Витаминам, минеральным веществам и пищевым волокнам. Количественное определение витамина с Биологическая роль витаминов А и Е

При глубоком изучении процессов пищеконцентратного и овощесушильного производства, при установлении пищевой ценности готовых продуктов, а также при контроле производства витаминизированных изделий определяют содержание в них следующих витаминов: витамина С (аскорбиновой кислоты), B1 (тиамина), B2 (рибофлавина), PP (никотиновой кислоты), каротина (провитамина A).

Подготовка проб при определении витаминов. Пробы исследуемых продуктов приготовляют непосредственно перед анализом. При анализе свежих плодов и овощей из отдельных экземпляров вырезают ножом из нержавеющей стали пробы в форме продольных сегментов, которые быстро измельчают ножом (капуста, лук) или на терке (картофель, корнеплоды), тщательно перемешивают и из полученной однородной массы отбирают пробу не менее 200 г, которую немедленно направляют на исследование.

Свежие ягоды и мелкие сочные плоды предварительно не измельчают; из средней пробы отбирают в банку из разных мест по нескольку ягод, плодов, перемешивают их и берут навеску для анализа. Из плодов и ягод с косточками удаляют косточки, а в дальнейшем поступают так, как описано выше.

Сухие плоды и овощи не менее 50 г измельчают на лабораторной мельнице или ножницами и полученный измельченный материал ссыпают в банку с притертой пробкой. Из тщательно перемешанной массы отбирают пробу для лабораторного анализа.

Пищевые концентраты в количестве не менее 200 г измельчают на лабораторной мельнице, перемешивают и отбирают пробу для анализа.

Витаминизированные молочные пищевые концентраты (в брикетированном виде) не менее 100 г измельчают и растирают в ступке, тщательно перемешивают и отбирают пробу для анализа.

Порошкообразные продукты в количестве не менее 50 г перед отбором пробы для исследования тщательно перемешивают.

При исследовании жидких, пюреобразных и пастообразных продуктов навески для анализа берут после тщательного перемешивания пробы.

Определение витамина C

Витамин C, l-аскорбиновая кислота (С6Н8O6), может находиться в пищевых продуктах в двух формах: восстановленной и окисленной (дегидроаскорбиновая кислота).

Количественные химические методы определения аскорбиновой кислоты основаны на ее восстановительных свойствах. Основными методами определения содержания аскорбиновой кислоты в препаратах и в пищевых продуктах является индофенольное или йодометрическое титрование. Применяемый индофенольный реактив - 2,6-дихлорфенолиндофенол, синего цвета, при титровании аскорбиновой кислоты восстанавливается и переходит в бесцветное лейкосоединение. Об окончании реакции судят по окрашиванию испытуемого раствора в розовый цвет, вызванному избытком индикатора, который в кислой среде имеет розовую окраску. По количеству индофенола, израсходованного на титрование, определяют содержание витамина С в продукте. При йодометрическом титровании применяют раствор йодноватокислого калия, индикатором служит крахмал.

При определении витамина C в пищевых продуктах применяют методы индофенольного титрования: арбитражный, с применением сероводорода и контрольный (упрощенный). Выбор метода зависит от свойств исследуемого продукта и назначения анализа.

Арбитражный метод (индофенольный с применением сероводорода)

Навеску исследуемого продукта 10-50 г в зависимости от предполагаемого содержания витамина C, взятую с точностью до 0,01 г, количественно при помощи 5%-ного раствора уксусной кислоты переносят в мерную колбу (или цилиндр) и этой же кислотой доводят содержимое колбы до объема 50-100 мл. При анализе концентратов и сушеных овощей и фруктов навеску 5-10 г растирают в ступке с 5-10 г стеклянного порошка или кварцевого песка (предварительно очищенного от примесей железа, промытого и прокаленного) и с трехкратным по отношению к навеске количеством 5%-ного раствора уксусной кислоты. При растирании анализируемый продукт должен быть полностью покрыт уксусной кислотой. Тщательно растертую смесь оставляют в ступке для настаивания на 10 мин, после чего содержимое ступки переливают в мерную колбу (или цилиндр) через воронку, стараясь не переносить осадка. Ступку, воронку и палочку несколько раз ополаскивают 5%-ным раствором уксусной кислоты, давая каждый раз отстояться осадку. Промывные жидкости сливают к испытуемому раствору в мерной колбе (или цилиндре) и доводят до объема 50-100 мл в зависимости от величины взятой навески и предполагаемого содержания витамина C. Содержимое мерной колбы или цилиндра тщательно перемешивают и центрифугируют или быстро фильтруют через слой ваты.

10 мл полученной уксуснокислой вытяжки пипеткой переносят в колбочку, стаканчик или центрифужную пробирку емкостью 60-80 мл и туда же прибавляют для создания необходимого pH и осветления раствора последовательно, при легком встряхивании, 0,4 г углекислого кальция и 5 мл 5%-ного раствора уксуснокислого свинца, приготовленного на 5%-ном растворе уксусной кислоты. Эту операцию следует проводить осторожно, так как прибавление углекислого кальция сопровождается пенообразованием. Раствор быстро центрифугируют или фильтруют в сухую колбочку через заранее приготовленный маленький складчатый фильтр.

Если фильтрат окажется мутным, то осветление повторяют на другой порции уксуснокислой вытяжки анализируемого продукта. Прибавляют к ней увеличенное в 2, 3 или 4 раза количество углекислого кальция и 5%-ного раствора уксуснокислого свинца, затем отфильтровывают или центрифугируют, как указано выше. Через прозрачный фильтрат в течение 5-15 мин пропускают ток сероводорода, получаемого из аппарата Киппа действием разведенной соляной (1:1) или серной (1:3) кислоты на сернистое железо. Для быстрого и полного осаждения сернистого свинца раствор в начале пропускания сероводорода энергично взбалтывают. Пропускание сероводорода заканчивают, когда слой жидкости над черным осадком сернистого свинца становится прозрачным. Раствор фильтруют через маленький сухой беззольный фильтр в сухую колбочку и из прозрачного фильтрата полностью удаляют сероводород током углекислого газа из баллона или аппарата Киппа, заряженного мрамором и разбавленной (1:1) соляной кислотой. Углекислый газ может быть заменен азотом. Контроль на полноту удаления сероводорода проводят при помощи фильтровальной бумаги, смоченной раствором уксуснокислого свинца, которую подносят к горлышку колбочки, в отсутствие сероводорода бумажка остается бесцветной, появление на ней желточерного пятна указывает на наличие сероводорода. Пропускание сероводорода и инертного газа следует проводить в вытяжном шкафу.

В колбочку предварительно приливают пипеткой 5 мл 80%-ного раствора уксусной кислоты и столько дистиллированной воды, чтобы общий объем жидкости с испытуемым раствором составил 15 мл. Затем вносят пипеткой от 1 до 10 мл испытуемого осветленного раствора, полученного после удаления сероводорода, и титруют из микробюретки или микропипетки 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 сек. Титрование проводят каплями при непрерывном легком встряхивании титруемого раствора. Титрование должно продолжаться не более 2 мин. После окончания титрования необходимо при энергичном взбалтывании раствора прибавить еще две капли раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; если окраска испытуемого раствора усилится, можно считать, что конец реакции был найден правильно, и в этом случае объем прибавленных капель индикатора не учитывают. При установлении количества испытуемого раствора, необходимого для титрования, следует исходить из того, чтобы на титрование израсходовалось не более 2 мл 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Определение витамина C проводят не менее чем в двукратной повторности, причем результаты параллельных титрований не должны отличаться между собой более чем на 0,04 мл. Содержание витамина C вычисляют как среднюю арифметическую величину из 2-3 параллельных определений. При вычислении результатов титрования следует вводить поправку на контрольное определение: титрование 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола смеси 5 мл 80%-пой уксусной кислоты и 10 мл дистиллированной воды до появления розового окрашивания. Эту поправку, равную обычно для объема 15 мл 0,06-0,08 мл, вычитают из общего количества индикатора, пошедшего на титрование испытуемого раствора.

где V - количество 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование с учетом поправки на контрольное титрование, мл; К - коэффициент пересчета на точно 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола; V1 - объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней экстрагирующей жидкости, мл; V2 - объем анализируемой жидкости, взятой для титрования, мл; V3 - объем первоначального раствора или экстракта, взятого для анализа после прибавления уксуснокислого свинца, мл; V4 - объем первоначального раствора или экстракта, взятого для анализа перед обработкой уксуснокислым свинцом; g - навеска продукта, г; 0,088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл точно 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Определение витамина C следует проводить не на прямом солнечном свете. Продолжительность анализа должна быть не более 1 ч.

Приготовление 0,001 н. раствора индикатора 2,6-дихлорфенолиндофенола

0,25-0,3 г индикатора взбалтывают в однолитровой мерной колбе с 600 мл дистиллированной воды в течение 1,5-2 ч (можно оставлять для растворения на ночь), доливают дистиллированной водой до 1 л, хорошо смешивают и фильтруют. Раствор индикатора пригоден для анализа в течение 5-10 дней. Хранить его следует в темноте, в прохладном месте, желательно в холодильнике.

Титр индикатора проверяют ежедневно. Появление при проверке титра грязноватого оттенка указывает на непригодность раствора индикатора для анализа.

Определение титра раствора индикатора - 2,6-дихлорфенолиндофенола

Титр раствора индикатора можно установить двумя способами.

Первый способ. К 5 мл раствора индикатора прибавляют 2,5 мл насыщенного раствора щавелевокислого натрия и титруют из микробюретки 0,01 н. раствором соли Мора, приготовленным на 0,02 н. растворе серной кислоты, до исчезновения синей окраски и перехода синевато-зеленоватого цвета в янтарно-желтый. Титр раствора соли Мора устанавливают по 0,01 н. раствору марганцовокислого калия, а титр последнего - по 0,01 н. раствору щавелевокислого натрия или щавелевой кислоте по общепринятым методикам.

Раствор соли Мора остается пригодным для анализа в течение 2-3 месяцев при хранении его в темном прохладном месте. Титр раствора соли Мора проверяют не реже 1 раза в месяц.

Второй способ. Несколько кристалликов аскорбиновой кислоты (примерно 1-1,5 мг) растворяют в 50 мл 2%-ного раствора серной кислоты. 5 мл этого раствора, взятого пипеткой, титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола из микробюретки до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 3 мин. Параллельно такой же объем (5 мл) раствора аскорбиновой кислоты титруют из другой микробюретки точно 0,001 н. раствором йодноватокислого калия (0,3568 г KJO3, высушенного в течение 2 ч при 105° С, растворяют в 1 л дистиллированной воды, полученный 0,01 н. раствор KJO3 перед анализом разбавляют в мерной колбе дистиллированной водой в 10 раз). Титрование проводят в присутствии нескольких кристалликов (1-2 мг) йодистого калия и 2-3 капель 1%-ного раствора крахмала до появления голубого окрашивания. Это титрование удобно проводить в фарфоровой чашечке.

Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (х) по аскорбиновой кислоте вычисляют по формуле

где V - количество 0,001 н. раствора KJO3, пошедшего на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл; V1 - количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл; 0,088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующей 1 мл точно 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, мг.

Контрольный упрощенный метод определения витамина С

Метод применяется при массовых анализах свежих плодов и овощей. Он позволяет определять аскорбиновую кислоту только в восстановленной форме. Точность метода ±20%.

Методика определения. Во взвешенный стаканчик берут в зависимости от предполагаемого содержания витамина C в продукте навеску 10-30 г и быстро заливают ее 50 мл 4%-ного раствора соляной кислоты; навески, залитые кислотой, можно хранить в течение 10-15 мин. Навеску вместе с кислотой переносят в фарфоровую ступку. Часть кислоты из ступки сливают в мерную колбу или цилиндр емкостью 100 мл, а навеску с небольшим количеством оставшейся кислоты тщательно растирают. Затем содержимое ступки переносят в тот же цилиндр (или колбу), в котором находится остаток соляной кислоты, смывая дистиллированной водой остаток из фарфоровой ступки в ту же мерную колбу (или цилиндр). Раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хорошо перемешивают и быстро фильтруют через марлю или воду. Из этого раствора отбирают пробу для титрования.

В случае труднорастираемых продуктов к навеске в фарфоровой ступке прибавляют 2-5 г взвешенного, хорошо промытого и прокаленного кварцевого песка или стеклянной пудры. После того как все содержимое ступки перенесено в мерную колбу (или цилиндр) и объем вытяжки доведен до 100 мл, к вытяжке добавляют дистиллированную воду в количестве 0,35 мл на каждый грамм взятого песка и всю жидкость снова хорошо перемешивают.

При исследовании жидкого материала его разбавляют в цилиндре 4%-ным раствором соляной кислоты и дистиллированной водой с таким расчетом, чтобы конечная концентрация соляной кислоты составляла 2%. Соляная кислота может быть заменена метафосфорной или щавелевой кислотой. Для получения вытяжки пользуются 2%-ным раствором метафосфорной кислоты, приготовленной на 2 н. растворе серной кислоты. Сначала приготовляют 20%-ный раствор метафосфорной кислоты на 2 н. растворе серной кислоты, а перед употреблением этот раствор разбавляют в 10 раз 2 н. раствором серной кислоты.

Навеску исследуемого продукта растирают в ступке с 2%-ным раствором метафосфорной кислоты (навеска должна быть покрыта кислотой), затем ее переносят в мерный цилиндр. Ступку несколько раз промывают небольшим количеством раствора метафосфорной кислоты, сливают эти растворы в цилиндр, доводя содержимое до 100 мл. Витамин C в растворе метафосфорной кислоты стабилен в течение нескольких часов. При отсутствии метафосфорной кислоты можно пользоваться щавелевой кислотой. Навеску исследуемого материала быстро растирают в ступке под 20 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и затем переносят содержимое фарфоровой ступки в мерный цилиндр емкостью 100 мл и доводят объем вытяжки до 100 мл при помощи 1%-ного раствора щавелевой кислоты. После перемешивания вытяжку фильтруют. Для титрования 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола отбирают от фильтрованной вытяжки не более 5 мл.

Титрование и вычисление содержания витамина C (в миллиграммах на 100 г продукта) производят так же, как и в арбитражном методе. Расхождение между результатами анализов двух параллельных навесок из одного продукта не должно превышать 3-4%.

Метод определения витамина C в сульфитированных сушеных продуктах

Метод основан на том, что сернистые соединения (в кислой среде) блокируются формальдегидом и не мешают титрованию аскорбиновой кислоты.

Навеску сушеного продукта, взятого с таким расчетом, чтобы витамина C в вытяжке содержалось 0,04-0,1 мг, растирают в ступке с 5%-ным раствором метафосфорной кислоты. Вытяжку фильтруют и в случае исследования несульфитированного продукта титруют 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола.

При анализе сульфитированного сушеного продукта полученную метафосфорную вытяжку подкисляют 50%-ным раствором серной кислоты и обрабатывают формальдегидом, концентрация которого в конечном растворе должна быть 4%. Раствор оставляют стоять на 8 мин, а затем титруют 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, как указано выше.

Определение каротина

Методы определения каротина основаны на извлечении его из растительных тканей бензином или петролейным эфиром и последующем освобождении от сопутствующих веществ при помощи адсорбционной хроматографии. Количественное определение каротина проводят колориметрированием полученных растворов, содержащих каротин. Для определения каротина предложены три варианта метода.

Методика определения. Первый вариант. Каротин извлекают из растительного материала после обезвоживания его спиртом или ацетоном, а затем омыляют вещества, перешедшие в экстракт, спиртовым раствором щелочи. Повторно извлекают каротин, фильтрат пропускают через адсорбционную колонку и затем определяют интенсивность окраски фильтрата.

Навеску измельченного продукта берут в количестве от 1 до 50 г в зависимости от содержания каротина и растирают ее в фарфоровой ступке с небольшим количеством промытого и прокаленного песка или измельченного стекла. К растертой массе в ступку приливают спирта или ацетона пятикратное количество, растирают, а затем добавляют порциями 20-30 мл бензина или петролейного эфира. Смесь растирают, экстракт фильтруют через бумажный фильтр; экстрагирование повторяют до тех пор, пока последние порции экстракта не станут бесцветными.

Фильтрат переносят в делительную воронку, добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды для разделения слоев: верхний - бензиновый, нижний - спиртовой или ацетоновый. В другую делительную воронку сливают спиртовой или ацетоновый слой и промывают 2 раза бензином или петролейным эфиром, присоединяя эти вытяжки к основному фильтрату. Соединенные вытяжки переносят в колбу и концентрируют до объема 20-30 мл на водяной бане при температуре не выше 50° С в вакууме. К экстракту добавляют приблизительно равный объем 5%-ной спиртовой щелочи и омыляют в течение 30 мин-1 ч на водяной бане с обратным холодильником при кипении раствора. Омыленный раствор переносят в делительную воронку, прибавляют несколько миллилитров воды, взбалтывают и отделяют бензиновый слой, который затем промывают 8-10 раз дистиллированной водой. Бензиновый экстракт переносят в колбу и сушат обезвоженным сульфатом натрия при взбалтывании до исчезновения мутности раствора, затем фильтруют и концентрируют до объема 5-10 мл, как указано выше. Сгущенный экстракт пропускают при небольшом разрежении через адсорбционную колонку, наполненную окисью магния или окисью алюминия. Каротин, адсорбированный на колонке, элюируют (растворяют) эфиром или бензином, пропуская их через адсорбент до тех пор, пока выходящая из колонки жидкость не станет бесцветной.

Полученный фильтрат собирают в мерную колбу, доводят объем жидкости до метки петролейным эфиром или бензином и колориметрируют в колориметре Дюбоска или на фотоэлектроколориметре, используя для сравнения стандартный раствор азобензола или бихромата калия.

Второй вариант. Вначале проводят омыление исследуемого вещества, а затем экстрагирование каротина, адсорбцию и колориметрирование. Навеску измельченного вещества (от 1 до 50 г), растертую в ступке, переносят в колбу, прибавляют 20-40 мл 5%-ной спиртовой щелочи, омыляют в течение 30 мин-1 ч и дальше поступают так же, как и при первом способе.

Третий вариант (упрощенный). При этом способе исключается омыление, а все остальные стадии анализа те же, что и при первом способе.

Полученные экстракты промывают водой, сушат над безводным сернокислым натрием, концентрируют до малых объемов, пропускают через колонку с адсорбентом и колориметрируют.

При определении каротина в моркови можно исключить применение адсорбционной колонки, так как в моркови содержится незначительное количество других каротиноидов, которые практически мало влияют на результат определения. Анализ по третьему варианту проводят в тех случаях, когда результаты определения каротина совпадают с результатами, полученными при работе по первому варианту. Определение каротина в сухом растительном материале (овощи, плоды, ягоды и другие продукты). Навеску измельченного вещества берут от 2 до 10 г, каротин извлекают бензином или петролейным эфиром без предварительной обработки спиртом. Полученные экстракты сгущают до объема 20-30 мл и омыляют спиртовым раствором КОН. Далее анализ проводят, как указано в первом варианте.

Вычисление содержания каротина. При использовании для колориметрирования колориметра Дюбоска и стандартных растворов азобензола или бихромата калия содержание каротина (х) в мг % в исследуемом продукте рассчитывают по формуле

где К - коэффициент пересчета (количество каротина в миллиграммах, соответствующее 1 мл стандартного раствора азобензола, - 0,00235 или стандартного раствора биххромата калия 0,00208); H - показание шкалы стандартного раствора, мм; H1- показание шкалы испытуемого раствора, мм; g - навеска исследуемого продукта, г; V - объем фильтрата после хроматографической адсорбции, мл.

При использовании электрофотоколориметра применяют следующую формулу:

где H2 - показание шкалы реохорда для стандартного раствора; H1 - то же, для испытуемого раствора. Остальные обозначения такие же, как и в предыдущей формуле.

Приготовление стандартных растворов

Раствор азобензола. 14,5 мг кристаллического химически чистого азобензола растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта.

Раствор бихромата калия. 360 мг трижды перекристаллизованного бихромата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Приготовление адсорбционной колонки

Для адсорбционной колонки используют стеклянную трубку длиной 12-15 см, диаметром 1-1,5 см, суженную книзу. Трубку вставляют через пробку в колбу Бунзена. В нижнюю часть адсорбционной трубки помещают вату, а затем адсорбент - окись магния или окись алюминия. Для этого приготовляют кашицу из адсорбента и бензина или петролейного эфира. Кашицей заполняют колонку на 4-6 см и промывают небольшими порциями растворителя, избегая образования пузырьков воздуха.

Определение витамина B1

Витамин B1 (тиамин, аневрин) находится в естественных продуктах как в свободном, так и в связанном виде. В первом случае - это свободный тиамин или его хлорид - гидрохлорид (C12H18O4Cl2); в связанном состоянии он представляет собой пирофосфорнокислый эфир тиамина, соединенный с белковым носителем, т.е. является коферментом карбоксилазы. В основу метода определения витамина B1, положена способность тиамина окисляться в тиохром феррицианидом калия в щелочной среде и свойство образовавшегося тиохрома давать голубую флуоресценцию при освещении ультрафиолетовыми лучами. В ходе анализа тиохром извлекают из водно-щелочного раствора изобутиловым, бутиловым или изоамиловым спиртом, отделяя его таким образом от флуоресцирующих и других нежелательных примесей, нерастворимых в указанных спиртах.

Содержание тиамина в исследуемом веществе устанавливают проводя на флуорометре сравнительное определение интенсивности флуоресценции испытуемого и стандартного растворов. Описанный метод применим для определения не только свободного тиамина, но и общего содержания тиамина. В этом случае связанную форму тиамина предварительно подвергают расщеплению ферментным препаратом, содержащим фосфатазу.

Флуорометрический метод определения витамина B1. Навеску исследуемого продукта в количестве 5-10 г, помещенную в ступку, тщательно растирают с 10-25 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и переносят количественно в колбу при помощи того же раствора кислоты; общий объем жидкости в колбе доводят приблизительно до 75 мл. Колбу закрывают пробкой с обратным холодильником (воздушным), опускают в кипящую водяную баню и в течение 45 мин при периодическом перемешивании содержимого ее ведут экстракцию тиамина. В случае определения свободного тиамина полученную вытяжку охлаждают, добавляют 2,5 молярного раствора уксуснокислого натрия до pH 5,0, доводят объем до 100 мл дистиллированной водой, перемешивают, фильтруют и 10-20 мл раствора берут для дальнейшего анализа.

При определении общего содержания тиамина вытяжку охлаждают до 35-40° С и добавляют в нее ферментный препарат, который в количестве 0,03 г на 1 г сухого вещества навески предварительно растирают в ступке с 2-3 мл 2,5 молярного раствора уксуснокислого натрия, затем полученную взвесь препарата переносят в колбу при помощи 2-3 мл раствора уксуснокислого натрия и этим же раствором доводят pH вытяжки до 5,0.

Колбу с вытяжкой после добавления ферментного препарата закрывают ватной пробкой и помещают на 12-15 ч в термостат при температуре 37° С. Затем содержимое колбы охлаждают, доводят объем дистиллированной водой до 100 мл, перемешивают и фильтруют. Дальнейшее определение свободного тиамина и общего его содержания проводят одинаково.

10-20 мл фильтрата пропускают через адсорбционную колонку для адсорбции тиамина. Для этой цели служит стеклянная трубка (рис. 25), имеющая следующие размеры: в верхней части - диаметр 25 мм и длину 90 мм, в средней части - диаметр 7 мм и длину 150 мм и в нижней части - диаметр 5 мм (внутренний диаметр 0,03-1,0 мм) и длину 30 мм. В среднюю часть трубки кладут стеклянную вату и сверху насыпают адсорбент; для катионита ОДВ-3 высота столбика должна быть около 8 см. Подготовленную к работе колонку укрепляют на пробке в мерном цилиндре емкостью 100 мл. Адсорбент промывают 10 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и пропускают через колонку испытуемый раствор. Затем адсорбент 3 раза промывают дистиллированной водой по 10 мл и элюируют тиамин с адсорбента нагретым до кипения 25%-ным раствором хлористого калия в 0,1 н. растворе соляной кислоты порциями по 6-7 мл. Элюат собирают в чистый градуированный цилиндр до объема 30 мл.

По 5 мл полученного раствора переносят пипеткой в две маленькие делительные воронки; в первую воронку добавляют 3 мл смеси для окисления тиамина (0,4%-ный раствор феррицианида калия в 15%-ном растворе едкого натра), перемешивают и приливают для извлечения образовавшегося тиохрома 12 мл изобутилового (бутилового или изоамилового) спирта. Во вторую воронку (контрольная проба) приливают 3 мл 15%-ного раствора едкого натра, перемешивают и добавляют 12 мл изобутилового спирта. Обе воронки встряхивают в течение 2 мин, оставляют смесь в покое до полного расслоения, отделяют нижний водно-щелочной слой, а спиртовой слой фильтруют через бумажный фильтр, в который предварительно помещают 2-3 г безводного сернокислого натрия; прозрачный фильтрат собирают в сухую пробирку, откуда его переносят в кювету флуорометра. Спиртовой раствор можно также обезвоживать сернокислым натрием непосредственно в делительной воронке; после внесения около 2 г реактива смесь встряхивают и обезвоженный раствор фильтруют через бумажный фильтр в сухую пробирку.

Раствор тиохрома из стандартного раствора тиамина готовят следующим образом: в две делительные воронки вносят градуированной пипеткой по 1 мл раствора, содержащего 1 мкг тиамина, добавляют по 4 мл 25%-ного раствора хлористого калия и затем в одну воронку приливают 3 мл смеси для окисления, а во вторую (контрольная проба) - 3 мл 15%-ного раствора едкого натра. Содержимое воронок перемешивают и добавляют в каждую воронку по 12 мл изобутилового спирта. В дальнейшем поступают, как описано выше.

Интенсивность флуоресценции подготовленных спиртовых растворов определяют на флуорометре (рис. 26) со специальными светофильтрами при помощи чувствительного гальванометра. Измеряют интенсивность флуоресценции в четырех растворах: в двух испытуемых (окисленном и контрольном неокисленном) и в двух стандартных (окисленном и контрольном неокисленном). В каждую кювету вносят около 8 мл изобутилового раствора.

где A - показание флуорометра для испытуемого окисленного раствора; B - показание флуорометра для испытуемого неокисленного раствора; A1 - показание флуорометра для стандартного окисленного раствора; B1 - показание флуорометра для стандартного неокисленного раствора; g - навеска исследуемого продукта, г; V1 - общий объем вытяжки, мл; V2 - объем вытяжки, взятый для адсорбции, мл; V3 - общий объем элюата, мл; V4 - объем элюата, взятый для окисления, мл; 1000 - коэффициент пересчета, мг.

Приготовление основных реактивов и препаратов

1. Стандартный раствор тиамина. 10 мг кристаллического тиамин-хлорида растворяют в 0,001 н. 25%-ном спиртовом растворе соляной кислоты в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор не изменяется в течение 1-1,5 месяцев при хранении его в темной склянке в прохладном месте. Для приготовления рабочего раствора 1 мл стандартного раствора вносят в колбу емкостью 100 мл и разводят дистиллированной водой до метки; раствор готовят перед анализом, он содержит 1 мкг тиамина в 1 мл.

2. 2,5 молярный раствор уксуснокислого натрия. 340 г уксуснокислого натрия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

3. 25%-ный раствор хлористого калия. 250 г хлористого калия растворяют в дистиллированной воде, добавляют 8,5 мл концентрированной соляной кислоты и доводят объем водой до 1 л.

4. Смесь для окисления - 0,04%-ный раствор феррицианида калия в 15%-ном растворе едкого натра. Смесь готовят перед анализом, смешивая 4 мл свежеприготовленного 1 %-ного раствора феррицианида калия с 96 мл 15%-ного раствора едкого натрия.

5. Ферментные препараты из пенициллиума нотатум или из аспергиллуса ориза.

6. Адсорбент катионит СДВ-3. Катионит измельчают до размера частиц от 0,5 до 0,13 мм в количестве 70% и менее 0,13 мм - 30%. Для освобождения от примесей железа обрабатывают его троекратно 10%-ной соляной кислотой каждый раз по 2 ч при 40-60° С, промывают дистиллированной водой до исчезновения реакции на хлор и активируют подсушиванием при температуре не выше 60-70° С.

Определение витамина B2

Витамин B2 (рибофлавин) C17H20N4O6 содержится в естественных продуктах как в свободном, так и в связанном состоянии. Известны три формы связанного рибофлавина: флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид и третья форма, прочно связанная с белком.

Метод определения витамина B2 основан на свойстве водных растворов рибофлавина давать интенсивную желто-зеленую флуоресценцию в ультрафиолетовом свете. При определении общего содержания витамина В2 флуорометрическим методом рибофлавин связанных форм переводят в свободное состояние ферментативным и кислотным гидролизом. В ходе анализа вытяжки из естественных продуктов обрабатывают последовательно перманганатом и гидросульфитом натрия для уменьшения количества флуоресцирующих примесей. Затем в отдельной пробе определяют интенсивность неспецифической флуоресценции, которая зависит только от оставшихся примесей; в этой пробе предварительно восстанавливают рибофлавин в бесцветную лейкоформу и таким образом «гасят» его флуоресценцию. При расчете содержания витамина B2 в исследуемом продукте данные по неспецифической флуоресценции вводят как поправку в результат определения общей флуоресценции.

Определения общего содержания витамина B2. Навеску продукта (5-10 г) тщательно растирают в ступке с небольшим количеством фосфатного буфера (pH 7,8-8,0), после чего переносят в колбу при помощи того же буферного раствора, доводя общее разведение до соотношения 1:15 или 1:20. Колбу с содержимым нагревают на кипящей водной бане в течение 45 мин при частом перемешивании, охлаждают до 30° С, проверяют величину pH и в случае сдвига в кислую зону снова доводят pH до 7,8-8,0 добавлением фосфатного буфера. К вытяжке добавляют ферментный препарат (трипсин, панкреатин или препарат из пенициллиума нотатум) в количестве 30 мг на 1 г сухого вещества навески, который предварительно растирают в ступке с 2-3 мл фосфатного буфера или уксуснокислого натрия. Вытяжку выдерживают в термостате при 37° С в течение 12-20 ч; при ферментативном гидролизе отщепляется прочно связанная с белком форма рибофлавина. После охлаждения вытяжку доводят дистиллированной водой до объема, соответствующего общему разведению 1:25 или 1:30, и фильтруют через складчатый фильтр.

В небольшую колбу вносят 5 мл фильтрата, приливают 5 мл 20%-ного трихлоруксусной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Раствор охлаждают и добавляют 1/4 объема 4-молярного раствора двузамещенного фосфата калия для доведения величины pH до 6,0. Затем к вытяжке приливают по каплям 4%-ный раствор перманганата для окисления флуоресцирующих примесей; раствор перманганата прибавляют обычно в количестве 0,2-0,4 мл до появления стойкой красноватой окраски вытяжки.

Вытяжку, обработанную перманганатом, оставляют в покое на 10 мин, а затем к ней приливают по каплям 3%-ный раствор перекиси водорода до тех пор, пока не исчезнет окраска; при добавлении перекиси водорода вытяжку непрерывно взбалтывают. К вытяжке прибавляют 0,2 мл рабочего раствора хлористого олова и 0,1 мл 2,5%-ного раствора гидросульфита натрия для восстановления флуоресцирующих примесей. Вытяжку энергично встряхивают в течение 20 мин для перевода обратимо восстановленного рибофлавина в окисленную флуоресцирующую форму. Объем вытяжки доводят водой до 15 мл, при наличии мути раствор фильтруют. В подготовленной вытяжке определяют интенсивность флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции стандартного рабочего раствора рибофлавина. Для этого вытяжку и рабочий раствор рибофлавина (см. ниже «приготовление реактивов») наливают по 8-10 мл в кюветы флуорометра и измеряют интенсивность флуоресценции по шкале гальванометра. Далее в обе кюветы добавляют по 0,1 г кислого углекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита, перемешивают содержимое кювет и снова измеряют интенсивность флуоресценции. В стандартном растворе рибофлавина флуоресценция гасится до нуля, а в исследуемой вытяжке сохраняется небольшая флуоресценция, что обусловлено наличием флуоресцирующих примесей, которые не удаляются полностью при обработке вытяжки указанными выше реагентами. Чтобы убедиться в полноте гашения флуоресценции рибофлавина, к пробам добавляют по 0,1 г гидросульфита и снова измеряют интенсивность флуоресценции. При полном гашении показания гальванометра не должны изменяться. Содержание рибофлавина в микрограммах на 1 г веществ (х) вычисляют по формуле

где А - показание флуорометра для испытуемого раствора (первый отсчет); В - показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения (второй отсчет); С - показание флуорометра для стандартного раствора, содержащего 0,4 мкг рибофлавина в 1 мл; 0,4 - концентрация стандартного раствора, мкг; g - навеска продукта, г; V - объем общего разведения, мл.

Приготовление основных реактивов

1. Стандартный раствор рибофлавина. Навеску рибофлавина в количестве 10 мг растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 250 мл. 1 мл такого раствора содержит 40 мкг рибофлавина. Раствор не изменяется в течение 1 месяца при хранении на холоду и в темноте. Перед определением приготовляют рабочий раствор, для чего в мерную колбу емкостью 100 мл вносят 37,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, 25 мл 4-молярного раствора двузамещенного фосфата калия, 1 мл стандартного раствора рибофлавина и доводят водой до метки. 1 мл рабочего раствора содержит 0,4 мкг рибофлавина.

2. Фосфатная буферная смесь (pH 7,8-8,0). Приготовляют 1/15-молярный раствор двузамещенного фосфата натрия (11,876 г перекристаллизованного Na2HPO4-2H2O в 1 л воды) и 1/15-молярный раствор однозамещенного фосфата калия (9,078 г перекристаллизованного КН2РO4 в 1 л воды). Смешивают 9,5 части первого раствора и 0,5 части второго раствора.

3. Раствор хлористого олова. 10г хлористого олова (SnCl2) растворяют в 25 мл концентрированной соляной кислоты. Полученный основной раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Перед каждым определением готовят рабочий раствор разбавлением 0,2 мл основного раствора водой до 100 мл.

4. Раствор гидросульфита натрия. 0,25 г Na2S2O4-2Н2O растворяют в 10 мл 2%-ного раствора двууглекислого натра. Раствор готовят перед употреблением.

5. Ферментные препараты: трипсин, панкреатин или ферментный препарат из пенициллиума нотатум.

Определение никотиновой кислоты (витамина PP)

В естественных продуктах витамин РР (никотиновая кислота) встречается в свободном и связанном виде: как никотиновая кислота C6H5O2N или ее амид C6H6ON2. Для определения никотиновой кислоты , который основан на взаимодействии никотиновой кислоты с бромистым роданидом или цианом. Образующееся при этом соединение в присутствии ароматических аминов (анилин, метол) в нейтральной или слабокислой среде дает производное, окрашенное в желтый цвет. Интенсивность окраски испытуемых растворов прямо пропорциональна количеству никотиновой кислоты и измеряется колориметрически.

Методика определения. Навеску измельченного исследуемого продукта берут в количестве 5 г, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и приливают 75 мл 2-н. раствора серной кислоты, смывая воронку и горлышко колбы раствором этой кислоты. Содержимое колбы энергично перемешивают. Колбу помещают в кипящую водяную баню и нагревают содержимое в течение 90 мин при периодическом перемешивании. После этого колбу охлаждают, доводят смесь до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. (Полученный гидролизат можно оставить на холоду до следующего дня).

Берут 25 мл фильтрата, помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, добавляют одну каплю фенолфталеина и вносят 10 н. раствор едкого натра до получения слабо-розового окрашивания (примерно 4 мл). Избыток щелочи устраняют 1-2 каплями 5 н. серной кислоты (до исчезновения розового окрашивания). Если раствор нагрелся, его охлаждают, а затем добавляют 2 мл раствора сернокислого цинка и 1-2 капли изоамилового спирта (для устранения пены). Затем при перемешивании содержимого колбы добавляют по каплям раствор 4 н. едкого натра до образования густого осадка гидроокиси цинка. Осаждение заканчивают добавлением раствора 1 н. едкого натра до появления бледно-розового окрашивания. В колбу добавляют 1-2 капли 5 н. серной кислоты (до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин при периодическом помешивании. Смесь в колбе доводят до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат используют для проведения цветных реакций, для этого применяют специальные пробирки с пришлифованными пробками, которые вставляют в штатив круглой формы. Одновременно при проведении цветных реакций испытуемых растворов аналогичные операции повторяют со стандартными растворами никотиновой кислоты. При этом ставят контроль на реактивы к стандартным растворам и на амины к испытуемым.

Перечень растворов, используемых при проведении анализа, приведен в табл. 5.

Для проведения цветных реакций в две пробирки (параллельные определения) приливают по 5 мл стандартного раствора никотиновой кислоты и в две пробирки по 5 мл дистиллированной воды, затем в четыре другие пробирки приливают по 5 мл испытуемого раствора. Все пробирки, помещенные в штатив, погружают в баню при температуре 50° С на 5 мин, после чего под тягой из бюретки добавляют по 2 мл роданбромидного раствора согласно табл. 5 (исключая контроль на амины). Жидкость в пробирках перемешивают и оставляют их в бане на 10 мин при температуре 50° С. Пробирки охлаждают в холодной воде до комнатной температуры, помещают в деревянный ящичек с гнездами для пробирок, закрывают ящик крышкой и оставляют стоять в темном месте в течение 10 мин. В пробирки добавляют по 3 мл раствора метола, содержимое перемешивают и оставляют в закрытом ящике на 1 ч в темном месте.

По истечении часа полученные растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре при синем светофильтре в кювете при толщине слоя 10 мм. Содержание никотиновой кислоты вычисляют следующим образом. Устанавливают величины оптической плотности испытуемого (n) и стандартного (n1) растворов с учетом поправок на контроль

где А - оптическая плотность испытуемого раствора; А1 - то же, стандартного; В - оптическая плотность контрольного раствора на амины; B1 - оптическая плотность контрольного раствора на реактивы.

В дальнейшем для расчета содержания никотиновой кислоты в мг% (x) используют следующую формулу:

где G - содержание никотиновой кислоты в 1 мл стандартного раствора, мгк; n - оптическая плотность испытуемого раствора с учетом контрольного раствора; n1 - оптическая плотность стандартного раствора с учетом контрольного раствора; g - навеска, г; V - общий объем гидролизата, мл; V1 - объем гидролизата, взятый для очистки сернокислым цинком, мл; V2 - конечный объем раствора после добавления сернокислого цинка, мл.

Приготовление реактивов

1. Стандартный раствор никотиновой кислоты (основной). 500 мг никотиновой кислоты помещают в колбу емкостью 500 мл, добавляют 5 мл 10 н. H2SO4 и, когда кристаллы растворятся, доводят до метки дистиллированной водой. 1 мл такого раствора содержит 1000 мкг никотиновой кислоты. Раствор пригоден в течение 1 года при хранении на холоде.

2. Стандартный раствор - рабочий. 5 мл основного стандартного раствора разбавляют до 1 л дистиллированной водой. 1 мл такого раствора содержит 5 мкг никотиновой кислоты (раствор приготовляют ежедневно).

3. Роданбромидный раствор (готовят перед употреблением). Приготовляют бромную воду, внося в дистиллированную воду бром до прекращения растворения капель брома. К охлажденной на льду бромной воде, взятой в количестве необходимом для анализа, прибавляют по каплям 10%-ный раствор роданистого калия или аммония до светло-желтого окрашивания, а затем 1 %-ный раствор тех же реактивов до полного обесцвечивания бромной воды. Добавляют постепенно, небольшими порциями, по 20-50 мг углекислого кальция до прекращения выделения пузырьков и образования мути. Раствор фильтруют в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде.

4. Раствор метола 8%-ный (приготовляют перед употреблением). 8 г перекристаллизованного метола растворяют в 0,5 н. растворе НСl и переносят в мерный цилиндр или колбу емкостью 100 мл, раствор доводят до метки 0,5 н. НСl.

Перекристаллизация метола. 500 мл 0,1 н. H2SO4 нагревают до кипения, в кипящий раствор добавляют 100 г метола, предварительно смешанного с 0,7 г NaHSO3; смесь нагревают до кипения. Если раствор сильно окрашен, добавляют 10 г активированного угля. Смесь немедленно переносят на предварительно нагретую воронку Бюхнера и фильтруют. В химический стакан переносят фильтрат, добавляют 0,3 г бисульфита натрия и 700 мл 96%-ного спирта; все перемешивают, погружают в ледяную воду и оставляют в темном месте на несколько часов. Выпавшие кристаллы метола фильтруют через Бюхнеровскую воронку, промывают на воронке 96%-ным спиртом из пульверизатора и высушивают на воздухе в темноте. Перекристаллизованный метол хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой в темном месте.

В статье представлены результаты экспериментальных исследований по выбору метода и разработке методики количественного определения филлохинона (витамина К1) в растениях. Обосновано преимущество хроматографического метода (обращенно-фазовой ВЭЖХ) перед спектрофотометрическим при определении филлохинона в составе комплекса БАВ растений. В соответствии с рекомендациями Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека (International Conference Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) была проведена валидация разработанной методики по показателям специфичность, линейность, воспроизводимость и точность. Установлено, что предложенная методика является специфичной, линейной, воспроизводимой и точной. На примере фармакопейных видов сырья, содержащих витамин К1, доказана универсальность применения методики при анализе растительных объектов.

филлохинон

витамин К1

крапивы листья

калины кора

кукурузы столбики с рыльцами

пастушьей сумки трава

валидация

1. Абышев А. З. Синтез, свойства и контроль качества витаминных препаратов и витаминоподобных веществ: учебно-методическое пособие / А. З. Абышев, С.Н. Трусов, Н.И. Котова, М. П. Блинова. – СПб. : Изд-во СПФХА, 2010. – 136 с.

2. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» В 6 ч. – Введ. 23.04.02. – М.: Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2002.

3. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2 Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М., 1989. – 400 с.

4. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации МР 2.3.1.2432 -08

5. Носов А. М. Лекарственные растения. – М.: ЭКСМО-Пресс, 1999. – 350 с.

6. Погодин И.С., Лукша Е.А. Разработка методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1; URL: www.сайт/107-8426

Введение

Витамин К относится к классу жирорастворимых витаминов, влияющих на систему гемостаза. К природным витаминам группы К относятся два типа метилированных хиноидных соединений с боковыми цепями, представленными изопреноидными звеньями: витамины К 1 и К 2 . В основе структуры указанных витаминов лежит система 1,4-нафтохинона. Витамин К1 (филлохинон) синтезируется всеми фотосинтезирующими организмами. Витамин К 2 (менахинон) синтезируется микрофлорой толстого кишечника. Биологическая роль витаминов группы К заключается в активации факторов свертывающей и противосвертывающей систем млекопитающих .

В настоящее время определена физиологическая потребность в витамине К для взрослых - 120 мкг/сутки и для детей - от 30 до 75 мкг/сутки .

В медицинской практике препараты растительного происхождения, содержащие филлохинон, используются для коррекции геморрагических осложнений. В Государственную фармакопею 11 издания включены следующие виды лекарственного растительного сырья, обладающие гемостатическим витамин К-зависимым эффектом: кора калины (Соrtex Viburni), столбики с рыльцами кукурузы (Styli cum stigmatis Zeae maydis), листья крапивы (Folia Urticae), трава пастушьей сумки (Herba Bursae pastoris) . Установлено, что витамин К 1 также содержится в траве тысячелистника, горца перечного, горца почечуйного и спорыша, что определяет возможность применения указанного сырья при желудочных, маточных и геморроидальных кровотечениях . В Государственной фармакопее, в настоящее время, отсутствуют методики определения филлохинона в растительном сырье. Для оценки целесообразности использования лекарственного растительного сырья в качестве источников витамина К1, актуальной проблемой является решение вопросов стандартизации и разработки методик, направленных на определение содержания филлохинона в растительных объектах.

Цель работы : разработка методики определения витамина К1 в лекарственном растительном сырье.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись официнальные виды лекарственного растительного сырья: кора калины, столбики с рыльцами кукурузы, листья крапивы, трава пастушьей сумки. Все виды сырья были приобретены через аптечные сети. Выбор рационального способа определения витамина К 1 проводили на основании оценки валидационных характеристик, полученных с помощью хроматографических и спектрофотометрических методов анализа. Для разработки методики количественного определения филлохинона в растительном сырье использовали метод обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектором на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме в следующих условиях: аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4,6х250 мм, с размером частиц 5 мкм; состав подвижной фазы: ацетонитрил-изопропанол-вода в соотношении 75:20:5; детектирование при длине волны 254 нм; температура колонки - комнатная; скорость подвижной фазы 1 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. Оценку результатов проводили по величине времени удерживания (t r) филлохинона, совпадающим с показателем t r РСО (20.00±1.00 мин.) и по величине площади пика филлохинона. Обработку результатов производили с использованием программного обеспечения LC Solutions.

Спектрофотометрическое определение содержания витамина К 1 проводили на приборе UNICO 2802S в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см.

Обработку результатов выполняли с использованием программы STATISTICA 8.0. Для описания полученных результатов, после проверки нормальности распределения, приводили значение среднего (X ср), стандартного отклонения (S), относительного стандартного отклонения (RSD), дисперсии (S 2), доверительного интервала среднего (Δx ср) при уровне значимости α=0,05.

В качестве стандартного образца использовали рабочий стандартный образец (РСО) витамина К 1 , выделенного методом препаративной колоночной хроматографии из гексанового извлечения листьев крапивы двудомной. Рабочий стандартный образец представляет собой желтую вязкую невысыхающую маслянистую жидкость, практически не растворимую в воде, растворимую в органических растворителях и растительных маслах, температура плавления -20ºС. Спектральные характеристики спиртового раствора рабочего стандартного образца (после удаления гексана) представлены на рис. 1.

Рис. 1. Спектр в УФ- и видимой области раствора РСО филлохинона (витамина К1)

Для максимального извлечения витамина К1 из исследуемых образцов подбирали следующие параметры пробоподготовки: степень измельченности сырья, вид экстрагента, количественные соотношения сырья и экстрагента, время и кратность экстракции, температурный и световой режим экстрагирования.

Результаты и обсуждение . С целью разработки рационального метода определения содержания витамина К 1 были подобраны условия для его извлечения из сырья. В качестве объекта для разработки методики служили листья крапивы. С учетом неустойчивости филлохинона к воздействию световой энергии, все этапы исследования проводили в условиях, предполагающих защиту извлечений от света. Полноту извлечения определяли методом ВЭЖХ по величине площади пика с t r 20.00±2.00 мин. В результате оценки влияния факторов пробоподготовки на полноту извлечения филлохинона были подобраны следующие параметры и условия: измельченность сырья - частицы, проходящие сквозь сито с величиной диаметра отверстий 0,5 мм; экстрагент - гексан; количественное соотношение «сырье:экстрагент» - 1:25; однократная экспозиция в течение 60 мин.; температурный режим - комнатная температура (20-22ºС).

Для разработки методики определения витамина К 1 в растениях спектрофотометрическим методом, предварительно был проведен сравнительный анализ спектров поглощений извлечений из фармакопейного сырья (рис. 2) и раствора РСО филлохинона (рис. 1). В результате было установлено, что доказать присутствие витамина К1 в сырье по референтному максимуму (249 нм) не представляется возможным, ввиду отсутствия данного максимума в спектре всех исследуемых объектов. Следовательно, методика определения витамина К1 в суммарном комплексе биологически активных веществ растительного сырья прямым спектрофотометрическим методом изначально не может быть положительно провалидирована по показателю «специфичность». Повысить показатель специфичности методики при использовании спектрофотометрии возможно при условии извлечения из сырья очищенного филлохинона, что требует введения дополнительных препаративных манипуляций на стадии пробоподготовки объекта исследования. Дополнительная очистка извлечения может отрицательно повлиять на экспрессность и точность методики в конечном результате.

Рисунок 2 - Спектры поглощения извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего филлохинон (Кр - листья крапивы, К - кора калины, Ку - столбики с рыльцами кукурузы, П - трава пастушьей сумки)

Наиболее приемлемым вариантом для определения витамина К 1 в растительном сырье представляется использование метода обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектором. По разработанным параметрам пробоподготовки сырья к анализу была разработана следующая методика: аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, заливают 25 мл гексана, закрывают пробкой и перемешивают на механическом встряхивателе в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу и отгоняют гексан на ротационном испарителе. Остаток количественно переносят в мерную колбу на 5 мл (пикнометр) с помощью 4 мл этанола. Доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.

Приготовление стандартного образца: К 0,0005 г (точная навеска) РСО филлохинона приливают 4 мл этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл. Доводят объем раствора до метки растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.

Содержание филлохинона (X) в абсолютно сухом сырье в процентах вычисляют по формуле:

где S o - площадь пика на хроматограмме раствора РСО филлохинона; S - площадь пика филлохинона на хроматограмме испытуемого раствора; m o - навеска РСО филлохинона, в г; m - навеска сырья, в г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %; Р - содержание филлохинона в РСО филлохинона, в %.

По результатам количественного определения филлохинона методом обращенно-фазовой ВЭЖХ было определено содержание витамина К1 в листьях крапивы (табл. 1).

Таблица 1 - Метрологическая характеристика метода количественного определения филлохинона в листьях крапивы (%) (n=6)

						Xср ± Δхср
						0,00425 ± 0,00021

Ввиду малого содержания витамина К1 в сырье предлагаем производить расчеты в мг%, для этого необходимо внести изменения в расчетную формулу для перевода единиц измерения (г в мг):

Валидационную оценку методики проводили по показателям - специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность .

Специфичность. Идентификация филлохинона подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента в сырье и РСО филлохинона (рис. 3). Пики сопутствующих соединений, входящих в состав извлечений растительного сырья, хорошо разделяются с пиком филлохинона, и не влияют на аналитическое определение.

Рис. 3. Хроматограмма извлечения листьев крапивы (А - пик 17,tr =20.37 мин соответствует филлохинону) и рабочего стандартного образца филлохинона (Б - пик 22 ,tr =20.71 мин)

Линейность и аналитическая область методики была подтверждена анализом 7 проб разных концентраций в диапазоне от 13 до 417 % от концентрации (0,12 мг/мл), принятой за 100 %. Сравнение зависимости между содержанием филлохинона (мг/мл) в испытуемых растворах и величинами площадей хроматографических пиков показало, что она имеет линейный характер и описывается уравнением y = 5104417,9 x + 10944,88. Коэффициент корреляции (rxy) равен 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения филлохинона в растительных объектах в диапазоне концентраций от 0,016 до 0,5 мг/мл.

Воспроизводимость (прецизионность) определялась путем проведения анализа разными (двумя) аналитиками на одной серии сырья в разное время. Число повторностей для каждого аналитика - 3, общее число повторностей - 6. Относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах (RSD, %), не должно превышать 5 % . По результатам проведенных исследований RSD составило 1,21 %, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты определения прецизионности методики

Повторность	Аналитик	Определено в образце, мг%	Метрологические характеристики
			Xср = 4,00525 мг % S = 0,04850 мг %

Для определения точности методики анализировали образцы листьев крапивы из одной партии сырья в 3 уровнях навесок (по 0,5, 1,0 и 1,5 г), трижды проводя отбор проб для каждого уровня. Содержание витамина К1 определяли в мг в навеске сырья. Предварительно рассчитывали ожидаемую (теоретическую) величину, исходя из установленного среднего показателя по содержанию витамина К1 в листьях крапивы, равного 4,1 мг%. Теоретический показатель значения сравнивали с фактическим. Для оценки полученных результатов использовали показатель «открываемость» (R), критерий приемлемости для которого принят в пределах 98-102 % от расчетной величины .

Таблица 3 - Результаты определения точности методики

Навеска сырья,	Фактическое	Расчетное	Открываемость	Метрологические характеристики

Результаты определения точности методики, представленные в таблице 3, показали, что открываемость R составляет 98,73 %, величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5 %, что характеризует точность методики как удовлетворительную.

Таким образом, установлено, что предлагаемая методика количественного определения витамина К1 методом ВЭЖХ в листьях крапивы является специфичной, воспроизводимой и точной. Данная методика была воспроизведена для определения витамина К1 в других видах лекарственного растительного сырья (табл. 4).

Таблица 4 - Содержание витамина К1 (мг%) в лекарственном растительном сырье

Объект (n=6)					Xср ± Δхср
Столбики с рыльцами кукурузы
Трава пастушьей сумки
Кора калины

Проведенные исследования показали целесообразность использования метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения филлохинона в растительном сырье. Преимуществом метода ВЭЖХ является возможность проведения оценки качественного и количественного содержания филлохинона в одной навеске сырья, что существенно экономит временные затраты на анализ. Разработанная методика может быть использована для определения содержания витамина К1 в растительных объектах.

Рецензенты:

Гришин А.В. д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой фармации ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г.Омск.

Пеньевская Н.А. д.м.н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г.Омск.

Библиографическая ссылка

Лукша Е.А., Погодин И.С., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Величко Г.Н. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЛЛОХИНОНА (ВИТАМИНА К1) В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 3.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=13736 (дата обращения: 02.09.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Бохан Иван

Людям еще в глубокой древности было известно, что отсутствие некоторых продуктов в пищевом рационе может быть причиной заболеваний.

Отсутствие витаминов в пище может приводить к тяжелым расстройствам в организме. Самым распространенным витамином является витамин С. С давних времен люди страдали от многочисленных тяжелых болезней, причины которых были неизвестны. Одна из таких болезней - цинга, ею обычно болеют люди на Крайнем Севере. Известно, что в экспедиции Васко да Гама от цинги погибло около 60% моряков, такая же судьба постигла русского мореплавателя В. Беринга и многих членов его экипажа в 1741 г., русского полярника Г.Я. Седова в 1914 г. и др. За время существования парусного флота от цинги погибло моряков больше, чем во всех морских сражениях, вместе взятых. И причиной тому был недостаток или гиповитаминоз витамина С.

Скачать:

Предварительный просмотр:

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение

«Средняя общеобразовательная школа № 25»

Секция естествознания

Определение содержания витамина С в продуктах питания

Выполнил: Бохан Иван

Учащийся 7В класса

Руководитель: Бохан Вера Васильевна, учитель химии

Абакан 2015

Введение ………………………………………………………………………….3

I. Теоретическая часть……………………………………………………………4

История открытия и изучения витамина С………………………………4
Биологическая ценность витамина С……………………………………..5
Суточная потребность в витамине С……………………………………...5
Витаминная недостаточность – авитаминоз……………………………..6
Признаки гипервитаминоза……………………………………………….6
Профилактика авитаминоза……………………………………………....7
Источники витамина С…………………………………………………...8

II. Практическая часть. Количественное определение содержания

Витамина С в продуктах питания йодометрическим методом…..………… 9

Приготовление рабочих растворов для определения витамина С….….9

Испытание растворов на точность………………………………………10

Определение аскорбиновой кислоты в продуктах……………..………10

Обработка полученных результатов ……………………..…………….10

Заключение……………………………………………………………………….11

Литература……………………………………………………………………….12

Приложение………………………………………………………………………13

Введение

В настоящее время из года в год мы опасаемся сезонных заболеваний ОРЗ. Одним из профилактических средств, является витамин С. «По данным отечественных исследователей, недостаток аскорбиновой кислоты у школьников в 2 раза снижает способность лейкоцитов уничтожать попавшие в организм болезнетворные микробы, в результате чего частота острых респираторных заболеваний увеличивается на 26–40%, и наоборот, прием витаминов значительно снижает показатель частоты ОРЗ» Я увидел, что данная тема актуальна и сегодня. Это натолкнуло меня на мысль исследовать это очень важное для человечества вещество.

Целью данной работы является изучение источников витамина С и значение для организма человека.

Для достижения поставленной цели, требуется решить следующие задачи:

Проанализировать литературу по данной теме
Изучить источники витаминов и их функции в организме
Исследовать содержание витамина С в некоторых пищевых продуктах

Объект исследования : пищевые продукты.

Предмет исследования: процессы выявления витамина С в продуктах питания.

Методы исследования: анализ литературы, эксперимент, наблюдение.

Гипотеза: содержание витамина С можно выявить в домашних условиях.

I. Теоретическая часть

1. История открытия и изучения витамина С

Витамин С или аскорбиновая кислота представляет собой белые кристаллы, растворимые в воде и имеющие вкус лимонного сока.

История открытия витамина С связана с цингой. В те далекие времена эта болезнь особенно поражала мореплавателей. Сильные, отважные моряки были бессильны перед цингой, которая к тому же часто вела к смертельному исходу. Болезнь проявлялась общей слабостью, кровоточивостью десен, вследствие чего выпадали зубы, появлялась сыпь, кровоизлияния на коже. Но все же был найден путь излечения. Так, моряки, следуя примеру индейцев, стали пить водный экстракт сосновой хвои, который является кладезем витамина С. В XVIII веке хирург британского флота Дж. Линд показал, что болезнь моряков можно излечить, добавив в их рацион питания свежие овощи и фрукты. Интересен еще другой факт: Альберт фон Сент- Дьердь, первооткрыватель витамина С, на самом деле открыл целый комплекс витаминов.

Огромная заслуга в исследовании его свойств принадлежит Лайнусу Полингу. Лайнус Карл Полинг один из немногих ученых, дважды в своей жизни удостаивавшихся высшей мировой оценки заслуг перед человечеством - Нобелевской премии. Лайнус Полинг - один из основателей современной химии и молекулярной биологии.

Надо отметить, что он является единственным человеком, получившим столь высокие награды единолично, ни с кем их не разделив. Исследованиями ученый занялся в середине 60-х годов. Его первая работа называлась “Витамин С и обычная простуда”. Но какую же волну возмущения и неприятия со стороны фармацевтической и медицинской общественности пришлось выдержать ученому, утверждавшему, что витамин С следует принимать в дозах, в 200 раз превышающих общепринятые! Между тем, Полинг, основываясь, как всегда, на строгих научных данных, призывал оппонентов обратиться к трудам Ирвина Стоуна, доказавшего, что печень большинства млекопитающих, за исключением человека и обезьян, синтезирует витамин С в количестве, пропорциональном весу тела животного. Составив пропорцию для человека, Полинг пришел к упомянутой цифре - доза витамина С, необходимая человеку для повышения сопротивляемости организма, должна в 200 раз превышать то количество, которое поступает с обычной пищей.

Полинг продолжал свои исследования, изучая влияние витамина С на развитие онкологических заболеваний. Поистине настоящий взрыв в американской медицине вызвала его книга “Рак и витамин С”, доказывающей фантастические возможности аскорбиновой кислоты. Именно в то время Лайнус Полинг получил прозвище Человек “Витамин С”. Но, несмотря на насмешки прессы, сопротивление медиков и фармацевтов, ученый продолжал работать. Его убеждения подтвердило время.

2. Биологическая ценность витамина С

Витамин С – мощный антиоксидант. Он играет важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов, участвует в синтезе коллагена и проколлагена, обмене фолиевой кислоты и железа, а также синтезе стероидных гормонов и катехоламинов. Аскорбиновая кислота также регулирует свертываемость крови, нормализует проницаемость капилляров, необходима для кроветворения, оказывает противовоспалительное и потивоаллергическое действие.

Витамин С является фактором защиты организма oт последствий стресса. Усиливает процессы, увеличивает устойчивость к инфекциям. Уменьшает эффекты воздействия различных аллергенов. Имеется много теоретических и экспериментальных предпосылок для применения витамина С с целью профилактики раковых заболеваний. Известно, что у онкологических больных из-за истощения его запасов в тканях нередко развиваются симптомы витаминной недостаточности, что требует дополнительного их введения.

Существуют данные, показывающие профилактическую роль витамина С в отношении рака толстой кишки, пищевода, мочевого пузыря и эндометрия (Block G., Epidemiology, 1992, 3 (3), 189–191).

Витамин С улучшает способность организма усваивать кальций и железо, выводить токсичные медь, свинец и ртуть.

Важно, что в присутствии адекватного количества витамина С значительно увеличивается устойчивость витаминов В 1 , В 2 , A, E, пантотеновой и фолиевой кислот. Витамин С предохраняет холестерин липопротеидов низкой плотности от окисления и, соответственно, стенки сосудов от отложения окисленных форм холестерина.

Наш организм не может запасать витамин С, поэтому необходимо постоянно получать его дополнительно. Поскольку он водорастворим и подвержен действию температуры, приготовление пищи с термической обработкой его разрушает.

3. Суточная потребность в витамине С

Суточная потребность человека в витамине С зависит от ряда причин: возраста, пола, выполняемой работы, состояния беременности или кормления грудью, климатических условий, вредных привычек.

Болезни, стрессы, лихорадка и подверженность токсическим воздействиям (таким, как сигаретный дым) увеличивают потребность в витамине С.

В условиях жаркого климата и на Крайнем Севере потребность в витамине С повышается на 30-50 процентов. Молодой организм лучше усваивает витамин С, чем пожилой, поэтому у лиц пожилого возраста потребность в витамине С несколько повышается.

Средневзвешенная норма физиологических потребностей составляет 60-100 мг в день. Обычная терапевтическая доза составляет 500-1500 мг ежедневно.[ ]

Для детей:

0-6 мес. - 30 мг

6 мес. до года - 35 мг

1-3 года - 40 мг

4-6 лет - 45 мг

7-10 лет - 45 мг

11-14 лет - 50 мг

Для мужчин и женщин от 15 лет и до 50 суточная потребность около 70 мг.

4. Витаминная недостаточность – авитаминоз

Недостаточность снабжения организма витаминами ведет к его ослаблению, резкий недостаток витаминов – к разрушению обмена веществ и заболеваниям – авитаминозам, которые могут окончиться гибелью организма. Авитаминозы могут возникать не только от недостаточного поступления витаминов, но и от нарушения процессов их усваивания и использования в организме.

По данным руководителя лаборатории витаминов и минеральных веществ Института питания РАМН проф. В.Б. Спиричева, результаты обследований в разных регионах России, показывают, что подавляющее большинство детей дошкольного и школьного возраста испытывает недостаток необходимых для их нормального роста и развития витаминов.

Особенно неблагополучно обстоит дело с витамином С, недостаток которого был выявлен у 80–90% обследованных детей.

При обследовании детей в больницах Москвы, Екатеринбурга, Нижнего Новгорода и других городов дефицит витамина С обнаруживается у 60–70%.

Глубина этого дефицита нарастает в зимне-весенний период, однако у многих детей недостаточная обеспеченность витаминами сохраняется даже в более благоприятные летние и осенние месяцы.

А ведь недостаточное потребление витаминов заметно снижает активность иммунной системы, повышает частоту и усиливает тяжесть респираторных и желудочно-кишечных заболеваний. Недостаточность может быть экзогенная (за счет недостатка аскорбиновой кислоты в продуктах питания) и эндогенная (за счет нарушения всасываемости и усвояемости витамина С в организме человека).

При недостаточности поступления витамина в течение длительного времени может развиваться гиповитаминоз.

5. Признаки гипервитаминоза

Витамин С хорошо переносится даже в высоких дозах.

Однако:

· При слишком больших дозах приема может развится диарея.

· Большие дозы могут вызвать гемолиз (разрушение красных кровяных клеток) у людей, страдающих отсутствием специфического фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Поэтому людям с таким нарушением можно принимать повышенные дозы витамина С только под строгим наблюдением врача.

· Если аскорбиновую кислоту принимать в больших дозах одновременно с аспирином, может возникнуть раздражение желудка, вследствие чего, разовьется язва (аскорбиновая кислота в виде аскорбата кальция имеет нейтральную реакцию и менее агрессивна по отношению к слизистой желудочно-кишечного тракта).

· При применении витамина С с аспирином следует также помнить, что большие дозы аспирина могут привести к усиленному выделению витамина С через почки и потере его с мочой и, следовательно, через некоторое время к дефициту витамина.

· Жевательные конфеты и жевательные резинки с витамином С могут повредить эмаль зубов, следует полоскать рот или чистить зубы после их приема.

6. Профилактика авитаминоза

Комитет экспертов ВОЗ ввел понятие о безусловно допустимой суточной дозе витамина С, которая не превышает 2,5 мг/кг веса тела, и условно допустимой суточной дозе витамина С, которая составляет 7,5 мг/кг (Шилов П.И., Яковлев Т.Н., 1974)

Профилактика витаминной недостаточности заключается в производстве пищевых продуктов, богатых витаминами, в достаточном потреблении овощей и фруктов, правильном хранении пищевых продуктов и рациональной технологической обработке их на предприятиях пищевой промышленности, общественного питания и в быту. При недостатке витаминов - дополнительное обогащение питания витаминными препаратами, витаминизированными пищевыми продуктами массового потребления.

Витамин C назначают при цинге, некоторых заболеваниях желудочно-кишечного тракта, кровотечениях, аллергиях, коллагенозах, атеросклерозе, инфекционных заболеваниях, профилактических интоксикациях.

Исследования позволили утверждать, что высокие дозы витамина C способствуют продлению жизни и улучшению состояния больных определенными видами рака. Имеются данные о том, что очень высокие дозы аскорбиновой кислоты могут препятствовать нормальному оплодотворению, вызвать выкидыши, повышать свертываемость крови, оказывать неблагоприятное действие на функцию почек и поджелудочной железы. Однако опасность передозировки аскорбиновой кислоты преувеличено. Результаты многочисленных исследований позволили считать, что гипервитаминоз C практически не проявляется.

Систематический прием больших доз витамина C снижает риск возникновения рака полости рта, пищевода, гортани, желудка, молочной железы, мозга. Большие дозы витамина C (около 1 г в сутки) несколько снимают крайне опасное воздействие табачного дыма на организм курильщика.

Помимо витаминных препаратов для профилактики гиповитаминоза используются плоды шиповника. Плоды шиповника отличаются относительно высоким содержанием аскорбиновой кислоты (не менее 0,2%) и широко применяются в качестве источника витамина С. Используют собранные в период созревания и высушенные плоды разных видов кустарников шиповника. Они содержат, помимо витамина С, витамины К, Р, сахара, органические, в том числе дубильные, и другие вещества. Применяют в виде настоя, экстрактов, сиропов, пилюль, конфет, драже.

Настой из плодов шиповника готовят следующим образом: 10 г. (1 столовую ложку) плодов помещают в эмалированную посуду, заливают 200 мл (1 стакан) горячей кипяченой воды, закрывают крышкой и нагревают в водяной бане (в кипящей воде) 15 мин, затем охлаждают при комнатной температуре не менее 45 мин, процеживают. Оставшееся сырье отжимают и доводят объем полученного настоя кипяченой водой до 200 мл. Принимают по 1/2 стакана 2 раза в день после еды. Детям дают по 1/3 стакана на прием. Для улучшения вкуса можно к настою прибавить сахар или фруктовый сироп.

Сироп из плодов шиповника готовят из сока плодов различных видов шиповника и экстракта ягод (рябины красной, рябины черноплодной, калины, боярышника, клюквы и др.) с добавлением сахара и аскорбиновой кислоты. Содержит в 1 мл около 4 мг аскорбиновой кислоты, а также витамин Р и другие вещества. Назначают детям (в профилактических целях) по 1/2 чайной или 1 десертной ложке (в зависимости от возраста) 2 – 3 раза в день, запивают водой.

7. Источники витамина С

Первоисточником витаминов служат главным образом растения. В организме человека аскорбиновая кислота не образуется, и отсутствуют ее накопления. Человек и животные получают витамины непосредственно с растительной пищей и косвенно - через продукты животного происхождения. В продуктах животного происхождения витамин С представлен незначительно (печень, надпочечники, почки). Значительное количество аскорбиновой кислоты содержится в продуктах растительного происхождения например, цитрусовые, овощи листовые зеленые, дыня, брокколи, брюссельская капуста, цветная и кочанная капуста, черная смородина, болгарский перец, земляника, помидоры, яблоки, абрикосы, персики, хурма, облепиха, шиповник, рябина, печеный картофель в «мундире». Травы, богатые витамином С: люцерна, коровяк, корень лопуха, песчанка, очанка, семя фенхеля, пажитник сенной, хмель, хвощ, ламинария, мята перечная, крапива, овес, кайенский перец, красный перец, петрушка, сосновые иглы, тысячелистник, подорожник, лист малины, красный клевер, плоды шиповника, шлемник, листья фиалки, щавель. Нормы содержания витамина С в некоторых пищевых продуктах (в мг на 100 г) смотри в приложении 1.

На содержание витамина C в пищевых продуктах значительное влияние оказывает хранение продуктов и их кулинарная обработка. Витамин C быстро разрушается в очищенных овощах, даже если они погружены в воду. Соление и маринование разрушают витамин C. Кулинарная обработка, как правило, приводит к снижению содержания аскорбиновой кислоты в продукте. Витамин C лучше сохраняется в кислой среде.

Аскорбиновую кислоту можно получать и синтетическим путем, ее выпускают в виде порошка, драже, таблеток с глюкозой и т. д. Аскорбиновая кислота входит в состав различных поливитаминных препаратов.

Помните, что лишь немногие люди и особенно дети едят достаточно фруктов и овощей, которые являются главными пищевыми источниками витамина. Еще больше его сгорает в организме под влиянием стресса, курения и других источников повреждения клеток, наподобие дыма и смога. Повсеместно используемые медикаменты, вроде аспирина в огромной степени лишают наш организм тех количеств витамина, которые нам все-таки удалось получить.

II. Практическая часть. Количественное определение содержания витамина С в продуктах питания йодометрическим методом

У аскорбиновой кислоты есть свойство, которого нет у всех остальных кислот: быстрая реакция с йодом. Поэтому мы использовали к оличественное определение содержания витамина С в продуктах питания йодометрическим методом.

Одна молекула аскорбиновой кислоты - С 6 Н 8 О 6 , реагирует с одной молекулой йода – I 2 .

1. Приготовление рабочих растворов для определения витамина С

Для определения витамина С в соках и других продуктах необходимо взять аптечную йодную настойку с концентрацией йода 5 %, т.е. 5 г в 100 мл. Однако, аскорбиновой кислоты в некоторых соках может так мало, что на титрование определенного объема сока (например, 20 мл) уходит всего 1-2 капли йодной настойка. При этом ошибка анализа оказывается очень большой. Чтобы результат был точнее, нужно брать много сока, либо разбавить йодную настойку. В обоих случаях число капель йода, израсходованных на титрование, увеличивается, и анализ будет точнее.

Для анализа фруктовых соков удобно к 1 мл йодной настойки добавить прокипяченной воды до общего объема 40 мл, то есть разбавить настойку в 40 раз и 1 мл его соответствует 0,88 мг аскорбиновой кислоты.

Чтобы узнать, сколько будет израсходовано на титрование йодной настойки необходимо вначале определить объём 1 капли: с помощью шприца отмерим 1 мл разбавленного раствора йода и посчитаем, сколько капель из обычной пипетки содержится в этом объеме. В одной капе содержится 0.02 мл.

Далее готовим крахмальный клейстер: для этого вскипятим ½ кружки воды, пока вода нагревается, размешаем 1/4 чайную ложку крахмала с ложкой холодной воды, так чтобы не было комочков. Выльем в кипящую воду и охладим.

2. Испытание растворов на точность.

Прежде чем приступить к анализу продуктов, испытаем наш раствор на точность. Для этого возьмем 1 таблетку чистого витамина, 0.1 г, растворим ее в 0.5 л кипяченой воды. Возьмем для опыта 25 мл, что соответствует содержанию витамина в 20 раз меньшей чем в таблетке. Дольем к этому раствору 1/2 чайной ложки крахмального клейстера и по каплям, добавим раствор йода до синего цвета. Определяем число капель и следовательно, объём израсходованного раствора йода, рассчитываем содержание витамина в растворе по формуле: 0.88* V=А мг, где V- объём раствора йода. В исходной таблетке А – в 20 раз больше, то А* 20= содержание аскорбиновой кислоты в таблетке. Результаты показали, что на титрование ушло 6 мл раствора что соответствует 5.28 мг витамина, домножив на 20 находим цифру 105.6 . Это означает что точность нашего анализа вполне достаточна

3. Определение аскорбиновой кислоты в продуктах

Мы взяли 25 мл исследуемого продукта добавили крахмала. Затем провели титрование раствором йода исследуемой жидкости до появления устойчивого синего окрашивания крахмала, которое говорит о том, что вся аскорбиновая кислота окислилась (Смотри приложение 2). Записали количество раствора йода, пошедшего на титрование, и произвели расчёт. Для этого мы составили пропорцию, зная что 1 мл 0,125%-ного раствора йода окисляет 0,875 мг аскорбиновой кислоты.

4. Обработка полученных результатов

На титрование 25 мл сока лимона ушло 7.1 мл раствора йода. Составили пропорцию:

1 мл йодног о раствора – 0,875 мг аскорбиновой кислоты

7.1 мл – X

X= 7.1 * 0,875/1=6.25 (мг)

Итак, в 25 мл сока содержится 6.25 мг аскорбиновой кислоты. Тогда в 100 мл сока содержится 6.25*100/25=25 мг

Подобным образом мы рассчитали содержание витамина С в остальных продуктах. Полученные данные занесли в таблицу1

Таблица 1. Результаты исследований

Анализируемый продукт	Количество сока для анализа	Объем раствора йода (в мл)	Количество витамина С в 25 мл сока	Количество витамина С в 100мл
Сок лимона (свежевыжатый)			6,25
Сок апельсиновый из упаковки				15,2
Перец красный сладкий		22,7
Сок яблока (зимний сорт)		0,45
Отвар шиповника		109,4	96,25
Аскорбиновая кислота (в таблетках)		28,4
Капуста белокочанная

Таким образом, в ходе выполнения работы, мы пришли к практическому выводу, что витамином С, который необходим для укрепления иммунной системы организма человека, наиболее богатые продукты – отвар шиповника, перец красный, капуста и лимон. Мы бы рекомендовали самое простое – готовить настой из плодов шиповника. Он очень вкусный, особенно с мёдом или фруктовым сиропом, поэтому его с удовольствием можно пить.

Из плодов шиповника можно также готовить сироп, добавляя к ним ягоды красной и черноплодной рябины, калины, клюквы, боярышника. Такой сироп можно употреблять по 1 ст.л. 3 раза в день, а маленьким детям давать 0,5-1 ч.л. – это обеспечит профилактику многих заболеваний.

Заключение

На основании исследуемой литературы и проделанной работы можно сделать следующие выводы:

Витамины – это важнейший класс незаменимых пищевых веществ. Говоря о витаминах, можно сказать, что важны они все, но витамин С - аскорбиновую кислоту , большинство биохимиков считают одним из величайших чудес живой природы. Молекула аскорбиновой кислоты настолько проста, активна и подвижна, что она способна легко преодолевать множество препятствий, участвуя в различных процессах жизнедеятельности.
Для получения организмом достаточного витамина С необходимо есть либо местные овощи, либо полученную синтетическим путем аскорбиновую кислоту.
Витамин С является одним из самых мощных антиоксидантов, и впервые он был выделен из сока лимона. Он прекрасно растворяется в воде, и это даёт ему ряд преимуществ – например, благодаря этому свойству витамин С может легко и быстро проникать туда, куда нужно, помогать иммунной системе ликвидировать сбои в организме, и запускать процессы, необходимые для здоровья и жизни человека. Однако это же свойство делает его уязвимым – аскорбиновая кислота разрушается при тепловой обработке продуктов.
Исследовать содержание витамина С в пищевых продуктах можно не прибегая к помощи специальной лаборатории, а сделать это в домашних условиях, что подтверждает выдвинутую нами гипотезу.
Витамин С – аскорбиновая кислота, обнаружен во фруктах и овощах при помощи раствора йода.
Наибольшее количество витамина С содержится в свежих овощах и фруктах, особенно в плодах шиповника, красном перце, лимоне.

Литература

Дудкин М. С., Щелкунов Л. Ф. Новые продукты питания. - М.: Наука, 1998.
Леенсон И. Занимательная химия, - М.:Росмен, 1999.
Скурихин И. М., Нечаев А. П. Все о пище с точки зрения химика. ‒ М.: Высшая

школа, 1991.

Смирнов М.И. «Витамины», М.: «Медицина» 1974 год.
Тюренкова И.Н. «Растительные источники витаминов», Волгоград 1999 .
Химический состав пищевых продуктов / Под ред. И. М. Скурихина, М. Н. Волгарева. ‒ М.: Агропромиздат, 1987.
. http://vitamini.solvay-pharma.ru/encyclopedia/info.aspx?id=13
.http://kref.ru/infohim/138679/3.html
“Энциклопедический словарь юного химика” - Москва 1990 Педагогика,650с.
http://vitamini.solvay-pharma.ru/encyclopedia/info.aspx?id=13

Приложение 1

		Наименование пищевых продуктов	Количество аскорбиновой кислоты
Овощи		Фрукты и ягоды
Баклажаны		Абрикосы
Горошек зеленый консервированный		Апельсины
Горошек зеленый свежий		Арбуз
Кабачки		Бананы
Капуста белокочанная		Брусника
Капуста квашеная		Виноград
Капуста цветная		Вишня
Картофель лежалый		Гранат
Картофель свежесобранный		Груша
Лук зеленый		Дыня
Морковь		Земляника садовая
Огурцы		Клюква
Перец зеленый сладкий		Крыжовник
Перец красный		Лимоны
Редис		Малина
Редька		Мандарины
Репа		Персики
Салат		Слива
Томатный сок		Смородина красная
Томат-паста		Смородина черная
Томаты красные		Черника
Хрен	110-200	Шиповник сушеный	До 1500
Чеснок	Следы	Яблоки, антоновка
Шпинат		Яблоки северных сортов
Щавель		Яблоки южных сортов	5-10
Молочные продукты
Кумыс		Молоко кобылье
Молоко козье		Молоко коровье

Приложение 2

Исследование сока раствором йода на содержание витамина С

1. Витамин В 1 (тиамин)

а) с диазореактивом

Принцип метода. Сначала образуется диазобензолсульфат (диазобензолсульфокислота):

Раствор тиамина при добавлении диазобензолсульфата и щелочи дает окрашенное соединение.

Ход работы. В пробирку последовательно добавляют:

б) окисления в тиохром

Принцип метода. При действии K 3 Fe(CN) 6 в щелочной среде тиамин окисляется в желтый тиохром, обладающий голубой флуоресценцией в УФ-свете.

Ход работы. 10 мг порошка тиаминбромида или тиаминхлорида растворяют в 5 мл воды, прибавляют 1мл 5%-го раствора железосинеродистого калия K 3 Fe(CN) 6 (феррицианид калия) и 1 мл 10%-го раствора едкого натра, и перемешивают. Половину получившегося объема нагревают и наблюдают окрашивание в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром. К другой половине добавляют 3 мл бутилового или изоамилового спирта, хорошо встряхивают и оставляют на несколько минут. Верхний, спиртовой слой дозатором отбирают в емкость из нефлуоресцирующего стекла и рассматривают в УФ-свете (можно – в лучах ртутно-кварцевой лампы в темном посещении). Хорошо заметна голубая флуоресценция.

в) снять спектр поглощения (модуль “спектральный”, диапазон от 350 до 220нм) и наблюдать максимум при λ=250-260 нм. График сохранить, перевести в Paint, затем вставить в файл “Графики” (документ Word), подписать и вклеить в отчет. ВНИМАНИЕ! Спектры всех витаминов сниматьодновременно , чтобы включать и прогревать спектрофотометр только один раз.

УФ-спектр тиамина гидрохлорида (8 мкг/мл) в растворе HCl 0,9%. Максимум при 246 нм.

2. Витамин В 2 (рибофлавин)

а) с металлическим цинком

Принцип метода. Рибофлавин восстанавливается выделяющимся водородом в бесцветный лейкофлавин. Наблюдается изменение окраски из желтой в зеленоватую, позже в малиновую, розовую, а затем – цвет исчезает.

Ход работы. В пробирку наливают 1мл взвеси рибофлавина в воде (0,015 - 0,025% раствор), добавляют 10 капель концентрированной HCl и опускают кусочек металическо-го цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода, и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться (обратное окисление лейкофлавина в рибофлавин).

б) с азотнокислым серебром

Принцип метода. Нейтральные или слабокислые растворы рибофлавина (рН 6,5-7,2), реагируя с AgNO 3 , дают соединение розово-красных тонов. Интенсивность окраски зависит от концентрации витамина.

Ход работы. К 1 мл р-ра рибофлавина (0,015 - 0,025%) добавляют 0,5 мл р-ра AgNO 3 (0,1%). Появляется розовое окрашивание.

в) флуоресценция в УФ + ее тушение после добавления SnCl 2 +Na 2 S 2 O 4 , которые тушат флуоресценцию самого витамина, но не примесей. Флуоресценция рибофлавина максимальна при рН 3,5-7,5. Снять спектр в растворе ацетата натрия.

УФ-спектр рибофлавина (35 мкг/мл) в растворе ацетата натрия CH 3 COONa

0,01%. Максимум при 266,5 нм. Дополнительные пики при 223,0 нм, 373,5 нм и 444,5 нм.

3. Витамин В 5 (РР, никотиновая кислота)

а) с ацетатом меди

Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.

Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты (или готовят 0,75% р-р никотиновой кислоты в горячей воде, а затем к 2 мл этого р-ра добавляют 1 мл 15%-ного р-ра уксусной к-ты). К нагретому до начала кипения раствору добавить равный объем 5%-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится голубоватой мутной, а при стоянии и охлаждении выпадает осадок никотината меди синего цвета.

б) на запах пиридина

Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с безводным Na 2 CO 3 ощущается неприятный запах пиридина.

Ход работы. В небольшом сухом фарфоровом тигле смешивают 0,05 г никотиновой к-ты с 0,1-0,15 г безводного углекислого натрия и подогревают. Появляется резкий запах пиридина.

4. Витамин В 6 (пиридоксин)

а) с хлорным железом

Принцип метода. Витамин В 6 образует с хлорным железом комплекс кроваво-красного цвета.

Ход работы. 4 мл 0,5-1% р-ра пиридоксина + 0,5мл 1%-ного FeCl 3 → встряхнуть и наблюдать красный цвет.

б) ДОПОЛНИТЕЛЬНО –

в) снять спектр в 0,1М NaOH (наблюдать максимумы при λ=245 и 308 нм) или воде (см.рис).

УФ-спектр пиридоксина гидрохлорида (15мкг/мл) в воде (рН≈6,0). Максимум при 291 нм.

5. Витамин В 12 – оформить в отчете, на практике не делаем в связи с высокой токсичностью действующего реактива.

Витамин В 12 реагирует с цианидом при рН=10 с образованием пурпурного дицианкобаламина, так как Со окисляется до 3х-валентного и 5’-дезоксиаденозин замещается на анион CN.

6. Витамин Р (на примере рутина)

К веществам Р-витаминного действия относится ряд соединений фенольной природы, основное физиологическое действие которых – уменьшение проницаемости и повышение прочности капилляров. Они способствуют усвояемости вит.С в организме человека и животных, активно участвуют в окислительно-восстановительных процессах, обладают антиокислительными свойствами, залерживая, среди прочего, и окисление адреналина. Они также инактивируют фермент гиалуронидазу, тем самым тормозя распад гиалуроновой кислоты – гетерополисахарида в основном веществе соединительных тканей. Вит. Р угнетают активность холинэстеразы, сукцинатдегидрогеназы и ряда других ферментов.

Витаминными свойствами обладает ряд флавонолов (рутин, кверцетин), флаванонов, катехинов, кумаринов, галловая кислота и ее производные, антоцианы (красящие вещества из плодов, ягод, цветков).

Многие вещества Р-витаминного действия – это гликозиды флавонолов и флаванонов или агликоны (неуглеводные компоненты гликозидов). Например, рутин – это гликозид, в котором к дисахариду рутинозе присоединен агликон фенольного строения флавонол кверцетин.

а) с хлорным железом

б) с серной кислотой

Принцип: Конц серная к-та образует с флавонами (рутином) оксониевые соли, обладающие в растворе желтой окраской. Флаваноны (например, гесперидин) дают с серной к-той малиновое окрашивание.

7. Витамин С

а) качественно - с K 3 Fe(CN) 6

Принцип метода: восстановление феррицианида калия витамином С с изменением окраски до синей из-за образования берлинской лазури.

Ход работы. В двух пробирках смешивают 5 капель 5%-го раствора К 3 Fe(CN) 6 c 5 каплями 1%-го раствора FeCl 3 . В одну из пробирок к зеленовато-бурой жидкости прибавляют 20 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты или сока капусты, а в другую - столько же дистиллированной воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску, выпадает синий осадок берлинской лазури; во второй пробирке (контроль) зеленовато-бурая окраска жидкости остается без изменения.

Методы количественного определения витаминов основаны на их физико-химических свойствах, таких как окислительно-восстановительные свойства, способность флуоресцировать в УФ-свете. Применяют различные методы определения: титрометрические, фотоколориметрические, спектрофотометрические, флуорометрические и др.

Количественное определение витамина К

Витамин К в листьях крапивы определяют методом СФМ (таблица 3).

Таблица 3 . Количественное определение витамина K в листьях крапивы (авторский метод)

Количественное определение БАВ в плодах шиповника.

Аскорбиновую кислоту можно определять титрометрическим методом, который основан на восстановлении 2,6-дихлорфенолиндофенола. С этим же реактивом можно провести фотоколориметрическое определение аскорбиновой кислоты. Для этого проводят экстракцию сырья 2 % метафосфорной кислотой, добавляют раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола. Через 35 сек. проводят фотоколориметрирование. Параллельно колориметрируют контрольный раствор 2 % метафосфорная кислота с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Интенсивность окраски пропорциональна количеству аскорбиновой кислоты.

Количественное определение аскорбиновой кислоты можно провести фотоколориметрическим методом с помощью гексацианоферрита калия. В кислой среде аскорбиновая кислота восстанавливает гексацианоферрит калия до гексацианоферрата калия, который в присутствии ионов железа (Ш) образует берлинскую лазурь, с последующим ее фотоколориметрированием.

Метод количественного определения аскорбиновой кислоты (по ГФ XI, вып. 2, стр. 294) основан на ее способности окисляться до дегидроформы раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята и восстанавливать последний до лейкоформы. Точка эквивалентности устанавливается появлением розового окрашивания, которое свидетельствует об отсутствии восстановителя, т. е кислоты аскорбиновой (2,6-дихлорфенолиндофенол имеет в щелочной среде синее окрашивание, в кислой - красное, а при восстановлении обесцвечивается):

1. Определение содержания аскорбиновой кислоты. (таблица 4). Из грубо измельченной аналитической пробы плодов берут навеску массой 20 г, помещают в фарфоровую ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком (около 5 г), постепенно добавляя 300 мл воды, и настаивают 10 мин. Затем смесь размешивают и извлечение фильтруют. В коническую колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл полученного фильтрата, 1 мл 2%раствора хлористоводородной кислоты, 13 мл воды, перемешивают и титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 с. Титрование продолжают не более 2 мин. В случае интенсивного окрашивания фильтрата или высокого содержания в нем аскорбиновой кислоты [расход раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолятанатрия (0,001 моль/л) более 2 мл], обнаруженного пробным титрованием, исходное извлечение разбавляют водой в 2 раза или более.

где 0,000088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), в граммах; V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Примечания . Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л): 0,22 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия растворяют в 500 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды при энергичном взбалтывании (для растворения навески раствор оставляют на ночь). Раствор фильтруют в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки. Срок годности раствора не более 7 сут при условии хранения в холодном, темном месте.

Установка титра. Несколько кристаллов (3-5) аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 2 % раствора серной кислоты; 5 мл полученного раствора титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розового окрашивания, исчезающего в течение 1-2 нед. Другие 5 мл этого же раствора аскорбиновой кислоты титруют раствором калия йодата (0,001 моль/л) в присутствии нескольких кристаллов (около 2 мг) калия йодида и 2-3 капель раствора крахмала до появления голубого окрашивания. Поправочный коэффициент вычисляют по формуле:

где V - объем раствора калий йодата (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; V1-объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедшего на титрование, в миллилитрах.

2. Определение содержания свободных органических кислот. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 25 г измельченных плодов шиповника помещают в колбу вместимостью 250 мл, заливают 200 мл воды и выдерживают в течение 2 ч на кипящей водяной бане, затем охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем извлечения водой до метки перемешивают. Отбирают 10 мл извлечения, помещают в колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 200-300 мл свеже-прокипяченной воды, 1 мл 1% спиртового раствора фенолфталеина, 2 мл 0,1 % раствора метиленового синего и титруют раствором натра едкого (0,1 моль/л) до появления в пене лилово- красной окраски.

где 0,0067-количество яблочной кислоты, соответствующее 1 мл раствора натра едкого (0,1 моль/л), в граммах; V - объем раствора натра едкого (0,1 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Таблица 4. Количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах шиповника (фармакопейный метод)

Количественное определение химических веществ в цветках календулы.

Каротиноиды определяют в лекарственном сырье фотоколориметрическим методом, основанном на измерении интенсивности их природной окраски. Разработан спектрофотометрический метод определения каротиноидов. Каротиноиды из сырья экстрагируют петролейным эфиром, затем хроматографируют на пластинке "Силуфол" в системе петролейный эфир-бензол-метанол (60:15:4), элюируют хлороформом и спектрофотометрируют при длине волны 464 нм (-каротин) при 456 нм (в-каротин).

1. Около 1 г (точная навеска) измельченных цветков ноготков, просеянных сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта 70 %, колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью ± 0,01 г) и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе восполняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр, отбрасывая первые 20 мл, в сухую колбу вместимостью 200 мл (раствор А).
1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора алюминия хлорида, 0,1 мл кислоты уксусной и доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и оставляют на 40 минут (раствор Б).

Через 40 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора Б и раствора стандартного образца Б 1 на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны (408 + 2) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя растворы сравнения для испытуемого раствора и стандартного образцов.

где: А - оптическая плотность испытуемого раствора;

А о - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

а - навеска сырья, г;

а о - навеска стандартного образца рутина, г;

W - влажность сырья, %;

Допускается проводить определение содержания суммы флавоноидов с использованием удельного показателя поглощения рутина.