Владельцы патента RU 2534617:

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к малым регуляторным молекулам, способным направленно изменять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. В частности, изобретение относится к применению производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий. Технический результат - производное тиазола, предназначенное для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармацевтике и касается малых регуляторных молекул, способных направленно изменять (ослаблять или усиливать) плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для контроля и управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека.

Обнаружение плотностно-зависимой коммуникации у бактерий с характеристикой лежащих в ее основе молекулярно-генетических механизмов стало одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века . При этом данный феномен коллективного поведения бактерий, обозначенный понятием «чувство кворума» (англ. - quorum sensing), позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование .

Первым из описанных и наиболее распространенным среди микроорганизмов вариантом «чувства кворума» являются luxI/luxR-подобные системы, в которых синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула-автоиндуктор диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, где, связываясь с регуляторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов . При этом анализ химической природы подобных автоиндукторов позволил охарактеризовать их как разнообразные варианты ацилированных гомосеринлактонов (ГСЛ) .

Расшифровка молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения, а также выявление важной биологической роли систем плотностно-зависимой коммуникации, определили актуальность поиска подходов к управлению чувством кворума. Предложенными решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его деградация специфическими ферментами (лактоназами или ацилазами); 3) использование агонистов и антагонистов ГСЛ, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с luxR-подобными белками . Именно последний подход, наиболее интенсивно разрабатываемый во многих лабораториях по всему миру и к настоящему моменту приведший созданию уже нескольких сотен активных соединений , составляет теоретическую основу для настоящего изобретения.

Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является патент , формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в зависимости от объекта воздействия способных вызывать либо активационные (агонистические), либо ингибирующие (антагонистические) эффекты в отношении опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у определенных видов бактерий. При этом в основу подобных веществ заявителями положено аналогичное природным ГСЛ лактонное кольцо, для придания которому дополнительных модулирующих активностей осуществлена ковалентная модификация ацильными группами различного строения и состава. Однако значительное структурное сходство предложенной группы молекул с естественными сигналами не только обеспечивает обозначенную заявителями возможность интерференции между ними, но потенциально сохраняет возможность развития неучтенных эффектов в отношении других микроорганизмов, плотностно-зависимая коммуникация между которыми опосредуется структурно схожими ГСЛ.

В свою очередь относительно химической структуры заявляемого соединения наиболее близким известным техническим решением является патент , формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в основу которых положено пятичленное кольцо тиазола, ковалентно связанное с замещенными или незамещенными циклоалкильными, арильными и др. группировками. Однако в данном патенте отсутствуют указания о возможности использования данных соединений для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий, а основным назначением заявленных соединений является их применение в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов.

Таким образом, заявляемое изобретение не известно из уровня техники, что определяет его соответствие требованию новизны.

Задачей данного изобретения является разработка структурно отличного от гомосеринлактнов соединения, обладающего избирательной и выраженной способностью к регуляции (как усилению, так и ослаблению) опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у определенного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий.

В настоящем изобретении эта задача решается применением соединения на основе тиазола, полностью описываемого формулой 1:

В данном изобретении раскрывается структурная формула соединения формулы 1 и способы его практического применения для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производного тиазола содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.

По сравнению с соединениями, составляющими сущность известных патентов , заявляемое соединение формулы 1 имеет ряд существенных отличий, а именно:

во-первых, в отличие от известных соединений, созданных на основе лактонного кольца и, в этой связи, являющихся близкими структурными аналогами природных авторегуляторных молекул - гомосеринлактонов , заявляемое соединение представляет собой структурно отличный от них синтетический лиганд. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе тиазола не известны;

во-вторых, в отличие от известных производных тиазола общей формулы 2

заявляемое соединение имеет только один вариант ковалентно присоединяемого радикала, по своему положению соответствующего R 4 и полностью описываемого аналогичным имеющемуся в молекуле естественного сигнала (гексаноил-гомосеринлактона) остатком гексановой кислоты, при отсутствии иных изменений по радикалам R 1 , R 2 и R 3 =Н. Кроме того, в отличие от известного патента , оговаривающего использование соединений общей формулы 2 в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов, заявляемое соединение формулы 1 предназначено для регуляции опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий;

в-третьих, благодаря структурным отличиям от природных авторегуляторных молекул, проявляющих активность во многих luxI/luxR-подобных системах, заявляемое соединение формулы 1 обладает избирательной (селективной) регуляторной активностью, реализуемой в отношении cviI/cviR-регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum, а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих, бактерий (см. пример 1). При этом вероятной причиной селективного действия соединения формулы 1 в названных системах «чувства кворума» лежит избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами, но не другими LuxR-подобными белками. В свою очередь природное разнообразие CviR-подобных белков определяет возможность их как позитивного, так негативного регулирования заявляемым соединением, что у различного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих бактерий будет проявляться либо как усиление (см. пример 1), либо как ослабление (см. пример 2) коллективного поведения.

Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединения формулы 1 регуляция «чувства кворума» включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR и его гомологов находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединения формулы 1.

Таким образом, результатом действия соединения формулы 1 является специфическая регуляция определенной системы «чувства кворума», направленность которой (усиление или ослабление) определяется рецепторными особенностями воспринимающих его CviR-подобных белков. Таким образом, с использованием одного и того же соединения оказывается возможным разнонаправленное воздействие на коллективное поведение различных микроорганизмов, в том числе изолированно или в их смешанной культуре.

Защищаемое применение соединения формулы 1 подразумевает, в том числе, его использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с помощью виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочное: виолацеин-производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединение формулы 1 может вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистого вещества или иммобилизованным на различных носителях.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединения формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данное соединение может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединение может использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенным на различные носители. Возможно также использование соединения формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (увеличивающими биодоступность, сроки действия) его биологическую активности.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Стимуляция коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием двух бактериальных тест-систем, в присутствии гексаноил-гомосеринлактона (С 6 -ГСЛ)? отвечающих синтезом пигмента виолацеина {Chromobacterium violaceum NCTC 13274) или развитием биолюминесценции {Escherichia coli pAL103). При этом особенностью первого являлась инсерция транспозона Тn5 в ген cvil, ответственного за синтез собственного С 6 -ГСЛ, с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им регуляторного белка, ответственного за восприятие автоиндуктора .

Quomm sensing and Chrornobacteriurn violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, P.3703-3711]. В свою очередь особенностью второго штамма являлось наличие генетической конструкции luxR+luxI_luxCDABE, кодирующей рецепторный белок LuxR Vibrio fischeri и в присутствии экзогенно вносимого С 6 -ГСЛ или С 6 -оксо-ГСЛ отвечающей развитием свечения (биолюминесценции) .

При проведении тестирования С. violaceum NCTC13274 и Escherichia coli pAL103 выращивались на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии С 6 -ГСЛ или соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация сравниваемых соединений, вызывающая индукцию образования пигмента виолацеина или биолюминесценции на 50% от максимально выраженного эффекта в присутствии естественного сигнала. Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.

Таблица 1. Оценка влияния соединения формулы 1 на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тестах на С. violaceum NCTC13274 и E.coli pAL103.

Из приведенных данных видно, что оба использованных микроорганизма интенсивно реагируют кворум-зависимым синтезом виолацеина (С. violaceum NCTC) или развитием биолюминесценции (Е. coli рAL103) в присутствии естественного авторегулятора С 6 -ГСЛ. В свою очередь тестируемое соединение формулы 1 действует менее активно, но более специфично, вызывая индукцию синтеза виолацеина, но не развитие биолюминесценции. При этом в основе подобных различий предположительно лежит избирательное сродство соединения 1 к воспринимающему регуляторный сигнал белку CviR при отсутствии такового к LuxR.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность избирательной индукции «чувства кворума» определенных видов бактерий, входящих в состав полимикробных ассоциаций.

Пример 2. Подавление коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием штамма Jantinobacterium lividum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под №В-10136. Данный штамм представляет собой природный изолят, характеризующийся способностью к синтезу пигмента виолацеина под контролем автоиндуктора неидентифицированной природы.

При проведении тестирования J. lividum В-10136 выращивался на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация соединения формулы 1, вызывающая подавление продукции виолацеина на 50% от максимально выраженного эффекта в контроле.

Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.2. Из приведенных данных следует, что тестируемое соединения формулы 1 подавляет продукцию виолацеина (ЕС50=87,5 мкМ), что характеризует его как ингибитор коллективного поведения («чувства кворума») J. lividum B-10136.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления «чувства кворума» определенных видов бактерий, в частности J. lividum, для предупреждения вызываемой ими порчи сельскохозяйственной продукции. Та же активность может быть использована при лечении и профилактике инфекционных заболеваний растений, животных и человека, вызываемых J. lividum и другими виолацеин-продуцирующими микроорганизмами.

Применение производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий:

Похожие патенты:

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым биологически активным веществам класса 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония, а именно к 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеноат тиазолиниламмония формулы (1).

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония, а именно к 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеноату тиазолинаммония (1) формулы обладающему антикоагулянтной активностью, что позволяет предположить его использование в медицине в качестве антикоагулянтного средства.

Изобретение относится к новым производным 2-(имино-замещенных)тиазолидинов, способу их получения, фармацевтическим средствам, содержащим эти вещества, применения указанных производных 2-(имино-замещенных) тиазолидинов для лечения различных заболеваний, а также получения фармацевтических составов на их основе, применяемых для лечения.

Изобретение относится к способу получения новых биологически активных химических соединений, конкретно к способу получения новых производных иминотиазолидина или их гидрохлоридов, обладающих антидепрессивной, антиэпилептической, антипаркинсоновой и анальгетической активностью.

Изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), где представляет собой α-конфигурацию; представляет собой β-конфигурацию; и представляет собой α-конфигурацию, β-конфигурацию или их произвольную смесь, его соль, или его смесь с диастереомером в произвольном соотношении, или его циклодекстриновый клатрат.

Изобретение относится к способу получения кристаллов А-формы 2-(3-циано-4-изобутилоксифенил)-4-метил-5-тиазолкарбоновой кислоты. Способ включает: стадию растворения при нагревании 2-(3-циано-4-изобутилоксифенил)-4-метил-5-тиазолкарбоновой кислоты в 1-пропаноле или 2-пропаноле, стадию охлаждения полученного раствора и стадию добавления к этому раствору гептана.

Изобретение относится к применению соединений общей формулы (I), обладающих свойствами ингибитора моноаминоксидаз (МАО), и/или липидного перокисления, и/или свойствами модуляторов натриевых каналов, а также к лекарственному средству на их основе, обладающему теми же свойствами, более конкретно соединения и лекарственное средство могут быть использованы для лечения болезни Паркинсона, старческого слабоумия, болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона, бокового амиотрофического склероза, шизофрении, депрессий, психозов, боли и эпилепсии.

Изобретение относится к соединению, представленное формулой (I), в которой A1 обозначает бензол или гетероцикл, выбранный из группы, состоящей из пиридина, пиразина, имидазола, тиазола, пиримидина, тиофена, пиридазина, бензоксазина и оксобензоксазина; A2 обозначает бензол, в случае необходимости замещенный фтором, или тиофен; B1 обозначает водород, низший алкил, в случае необходимости замещенный пиперазинилом или морфолино, галогензамещенный низший алкил, низший алкокси, замещенный карбамоилом, ациламино, карбамоил или низший алкилкарбонилокси (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B1 не обозначает ациламино); B2 обозначает водород или функциональную группу, содержащую по меньшей мере один атом азота, выбранную из группы, состоящей из ациламино, пирролидинила, морфолино, пиперидинила, в случае необходимости замещенного ацилом, пиперазинила, в случае необходимости замещенного низшим алкилом или ацилом, пиразолила, диазабициклогептила, в случае необходимости замещенного ацилом, и ди-(низший алкил)амино, в случае необходимости замещенного амино или ациламино (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B2 не обозначает ациламино); Y обозначает группу, представленную формулой (II), в которой J обозначает этилен или низший алкинилен; L обозначает связь; M обозначает связь; X обозначает -(CH2)m-, -(CH2)m-O- или -(CH2)m-NR2- (где m означает целое число от 0 до 3, и R2 обозначает водород); D обозначает -NR3-, где R3 обозначает водород; и E обозначает амино, или его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к соединениям формулы 1.0: где Q представляет собой тетрагидропиридинильное кольцо замещенное. R5, R1 выбирают из группы, состоящей из: (1) пиридила, замещенного заместителем, выбираемым из группы, состоящей из: -O-СН3, -O-C2H5, -O-СН(СН3)2, и -О-(СН2)2-O-СН3, R2 выбирают из группы, состоящей из: -ОСН3 и -SCH3; и R5 выбирают из группы, состоящей из: (a) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен одной или двумя алкильными группами, выбранными из группы, состоящей из: -С1-С4алкила, (b) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С1-С4алкилом, (c) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С2алкилен-O-С1-С2алкилом, (d) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С2-С4алкилен-O-СН3, и (e) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота гидрокси-замещенным -С1-С4алкилом, и где фенил необязательно замещен от 1 до 3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена; и их фармацевтически приемлемым солям и сольватам, которые заявлены в качестве ингибиторов ERK.

Изобретение относится к новому средству, представляющему собой производные роданина формулы (I), для лечения опухолевых заболеваний различной локализации. Технический результат - средство антипролиферативного и антиметастатического действия для лечения опухолевых заболеваний.

Предложены применение (R)-5--2-(-пропилимино)-3-орто-толилтиазолидин-4-она (Соединение 1) или его соли для получения лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни или расстройства, связанного с активацией иммунной системы, где лекарственный препарат представляет собой набор доз Соединения 1, причем в течение начальной фазы лечения доза индуцирует десенсибилизацию сердца и она ниже конечной дозы, и при указанной начальной фазе лечения доза вводится с частотой, которая обеспечивает поддерживание десенсибилизации сердца до тех пор, пока не произойдет следующее острое снижение частоты сердечных сокращений, а затем дозу титруют с повышением до конечной дозы Соединения 1; соответствующие способ лечения и набор доз.

Изобретение относится к соединению формулы I или его терапевтически приемлемым солям, где А1 представляет собой фурил, имидазолил, изотиазолил, изоксазолил, пиразолил, пирролил, тиазолил, тиадиазолил, тиенил, триазолил, пиперидинил, морфолинил, дигидро-1,3,4-тиадиазол-2-ил, бензотиен-2-ил, бензотиазол-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, триазолопиримидин-2-ил или имидазо-тиазол-5-ил; где А1 незамещен или замещен одним, или двумя, или тремя, или четырьмя или пятью заместителями, независимо выбранными из R1, OR1, C(O)OR1, NHR1, N(R1)2, C(N)C(O)R1, C(O)NHR1, NHC(O)R1, NR1C(O)R1, (O), NO2, F, Cl, Br и CF3; R1 представляет собой R2, R3, R4 или R5; R2 представляет собой фенил; R3 представляет собой пиразолил или изоксазолил; R4 представляет собой пиперидинил; R5 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен заместителями, выбранными из R7, SR7, N(R7)2, NHC(O)R7, F и Cl; R7 представляет собой R8, R9, R10 или R11; R8 представляет собой фенил; R9 представляет собой оксадиазолил; R10 представляет собой морфолинил, пирролидинил или тетрагидропиранил; R11 представляет собой C1-C10алкил; Z1 представляет собой фенилен; Z2 представляет собой пиперидин, не замещенный или замещенный OCH3, или пиперазин; Z1A и Z2A оба отсутствуют; L1 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен R37B; R37B представляет собой фенил; Z3 представляет собой R38 или R40; R38 представляет собой фенил; R40 представляет собой циклогексил или циклогексенил; где фенилен, представленный Z1 не замещен или замещен группой OR41; R41 представляет собой R42 или R43; R42 представляет собой фенил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом, имидазолилом или пиразолом; R43 представляет собой пиридинил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом; где каждый вышеуказанный циклический фрагмент, представленный R2, R3, R4, R8, R9, R10, R38, R40, R42 и R43, независимо не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из R57, OR57, С(О)OR57, F, Cl CF3 и Br; R57 представляет собой R58 или R61; R58 представляет собой фенил; R61 представляет собой C1-C10алкил; и где фенил, представленный группой R58, не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из F и Cl. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные соединения, и к способу лечения заболеваний, при которых экспрессируются антиапоптотические белки Bcl-2. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 48 пр.

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к малым регуляторным молекулам, способным направленно изменять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение у бактерий. В частности, изобретение относится к применению производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора коллективного поведения у бактерий. Технический результат - производное тиазола, предназначенное для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Химическая коммуникация у бактерий (Quorum Sensing регуляция)

И.А. Хмель, ИМГ РАН

В последние годы внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, было обращено на явление, получившее название Quorum Sensing (QS). Quorum Sensing (QS) – это особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящей от плотности их популяции. QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы, названные аутоиндукторами, легко диффундирующие через клеточную стенку, и регуляторные белки, с которыми связываются аутоиндукторы (AI). По мере того, как популяция бактерий увеличивается и достигает критического уровня, AI накапливаются до необходимого порогового значения и взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, что приводит к резкой активации (индукции) экспрессии определенных генов у бактерий. С помощью AI осуществляется коммуникация бактерий - межклеточная передача информации между особями бактерий, принадлежащих к одному и тому же и разным видам, родам и даже семействам; поэтому сигнальные молекулы считают «словами» в этом своеобразном «языке» бактерий. Благодаря QS регуляции бактерии получают возможность скоординированно контролировать экспрессию генов во всем сообществе. В подобном поведении бактерий проявляются черты сходства с многоклеточными организмами; бактерии используют преимущества «социального» поведения, которые не были доступны им как индивидуальным клеткам. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям среды и их выживанию в природных условиях.

Впервые QS регуляция была обнаружена и описана в начале 70-х годов у светящейся морских бактерии Vibrio fischeri . У этой бактерии способность к биолюминесценции за счет синтеза люциферазы кодируется lux опероном (luxCDABE ), и биолюминесценция происходит только при высокой плотности популяции бактерий (до 10¹¹ клеток/мл). V . fischeri живет в симбиозе с некоторыми морскими животными, в специализированном световом органе животного. В этой симбиотической ассоциации животное – хозяин обеспечивает бактерию богатой питательной средой, а бактерия хозяина – светом. Каждый эукариотический организм использует свет для своих специфических целей. Например, улитка Euprymna scolopes , освещая себя с помощью V . fischeri , не отбрасывает тени при свете луны и звезд, что помогает ей спасаться от врагов. Рыба Monocentris japonicus использует свет для привлечения партнера [по 3].

Довольно долго считалось, что QS регуляция – это весьма редкий случай, однако, в последние годы выяснилось, что этот тип регуляции широко распространен у бактерий различных таксономических групп. В настоящее время QS регуляция обнаружена у более чем 50 видов бактерий. Большое разнообразие соединений используется бактериями в качестве аутоиндукторов QS систем; количество вновь обнаруженных AI увеличивается. При этом один вид бактерий может использовать и узнавать более чем один тип сигнальных молекул.

В настоящее время показано, что регуляторные системы типа QS играют ключевую роль в большом количестве процессов бактериальной клетки. Они участвуют во взаимодействии многих бактерий с высшими организмами, животными и растениями, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др. Использование в последние годы методов транскриптомного и протеомного анализа показало, что QS системы функционируют как глобальные факторы регуляции. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии бактерий определяет совершенно новый подход к изучению поведения бактерий в природных условиях; эти исследования могут иметь огромное прикладное значение.

Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом – хозяином. Инфекционный процесс происходит при достижении достаточно больших популяций патогенных бактерий; при этом увеличение концентрации сигнальных молекул в среде приводит к синхронному синтезу факторов вирулентности, способствующих разрушению тканей организма. Такая стратегия способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма – хозяина.

Способность бактерий формировать биопленки является существенным фактором их патогенности. Биопленки – физические структуры с уникальными характеристиками, образуемые связанными с поверхностями микробными сообществами. Образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в окружающей среде, в том числе, в организме - хозяине. Способность бактерий существовать в составе биопленок создает большие трудности для медицинской практики, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к действию антибактериальных препаратов, а также к воздействию дезинфектантов, неблагоприятных факторов среды, таких как низкие или высокие уровни pH, высокая осмотическая сила и др., и действию иммунной защиты организма-хозяина. Образование бактериальных биопленок на имплантируемом оборудовании (например, катетерах, искусственных клапанах сердца, линзах и др.) является причиной ряда тяжелых, чрезвычайно трудно излечиваемых хронических заболеваний. Было показано, что QS регуляция играет важнейшую роль в формировании биопленок

Тот факт, что QS может быть важным фактором регуляции вирулентности бактерий, обусловил новое направление исследований, связанное с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. Предполагается, что подавление функционирования QS систем может обеспечить новые способы лечения, приводя к фактическому превращению патогенных бактерий в непатогенные без использования обычно применяемых антибиотиков и других лекарственных средств. В настоящее время этот подход рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии. В большом количестве лабораторий проводится поиск и изучение веществ, подавляющих QS. Ниже будут рассмотрены известные QS системы у бактерий и перспективы создания лекарственных препаратов нового поколения, направленных непосредственно на подавление патогенности бактерий.

Quorum Sensing системы у бактерий и м олекулярные механизмы

их действия

QS системы грамотрицательных бактерий LuxI - LuxR типа.

У грамотрицательных бактерий лучше всего изучены QS системы, функционирующие с участием аутоиндукторов N-ацил-гомосеринлактонов (AHL, или AI-1). AHL включают гомосеринлактонное кольцо и боковые ацильные группы. Описано более 40 AHL, отличающихся длиной ацильных цепей в молекуле. Специфичность действия AHL определяется количеством ацильных групп (от С4 до С16) и присутствием некоторых дополнительных группировок. AHL, содержащие короткие ацильные цепи, свободно диффундируют через клеточные мембраны; AHL с длинными ацильными цепями для выхода из клеток нуждаются в активном транспорте. AHL взаимодействуют с регуляторными белками, гомологичными LuxR белку Vibrio fischeri , которые составляют семью LuxR – подобных белков. Молекулы этих белков содержат два домена, определяющие связывание белка с AHL и с ДНК. При присоединении AHL изменяется конфигурация LuxR-подобного белка, в результате чего он может связываться с ДНК и функционировать как активатор транскрипции.

В биосинтезе AHL у нескольких изученных в этом отношении бактерий участвует S-аденозил метионин (SAM) (образование гомосеринлактонного кольца) и белок ACP, переносчик ацильных групп.

QS системы, функционирующие с участием AHL, обнаружены у большого количества грамотрицательных бактерий, включающих роды Agrobacterium , Aeromonas , Burkholderia , Chromobacterium , Citrobacter , Enterobacter , Erwinia , Hafnia , Pantoea , Pseudomonas , Ralstonia , Rhodobacter , Rhizobium , Serratia , Vibrio , Yersinia и т. д. Среди них - бактерии, являющиеся патогенными и фитопатогенными.

Наиболее подробно исследована QS регуляция lux оперона Vibrio fischeri . В ней участвуют два основных регуляторных компонента: 1) LuxI белок (синтаза

аутоиндуктора) отвечает за продукцию N-(3-оксогексаноил)- гомосеринлактона (3OC12-HSL); 2) LuxR белок присоединяет аутоиндуктор, и затем комплекс LuxR-3OC12-HSL, связываясь с промотором lux оперона, активирует его транскрипцию, что приводит к синтезу люциферазы и эмиссии света. Когда культура Vibrio fischeri растет, 3OC12-HSL накапливается до порогового уровня, который достаточен для активации LuxR, связывания его с промоторной областью lux оперона и индукции этого оперона. Т.к. ген синтазы аутоиндуктора LuxI входит в состав этого оперона, количество AI в этих условиях резко увеличивается, что приводит к дальнейшей индукции lux оперона и синтезу люциферазы.

Из патогенных бактерий лучше всего изучены QS системы Pseudomonas aeruginosa . В клетках Pseudomonas aeruginosa , оппортунистического патогена человека, вызывающего тяжелые инфекции дыхательных путей, большое количество генов, включая гены, ответственные за синтез факторов вирулентности, активируются двумя QS системами LuxI-LuxR типа: LasI-LasR и RhlI-RhlR. LasI белок отвечает за продукцию аутоиндуктора N-3(оксододеканоил) гомосеринлактона (3OC12-HSL), RhlI белок является синтазой N-бутаноил- гомосеринлактона (C4-HSL), участвует в регуляции образования биопленок. LasI-LasR система регулирует синтез секретируемых факторов вирулентности, ответственных за деструкцию тканей организма–хозяина при инициировании инфекционного процесса: эластазы, кодируемой геном lasB , протеазы, кодируемой lasA , экзотоксина, кодируемого toxA , щелочной фосфатазы, кодируемой геном aprA . LasR-LasI QS система активирует также экспрессию генов второй QS системы P . aeruginosa , RhlI-RhlR, приводя к ее индукции. Комплекс белка RhlR с соответствующим аутоиндуктором C4-HSL индуцирует экспрессию двух генов, регулируемых QS системой первого типа, lasB и aprA , и. еще нескольких генов, важных для вирулентности бактерий и их выживания в природных условиях. Было показано, что экспрессия более 600 генов P . aeruginosa контролируются QS.

Показано, что 3OC12-HSL может оказывать непосредственное действие на организм: молекулы 3OC12-HSL взаимодействуют с компонентами иммунной системы, такими, как интерлейкины, модулируя иммунный ответ организма на инфекцию P . aeruginosa ; ингибируют пролиферацию лимфоцитов, дифференциацию T-клеток, продукцию цитокинов, уменьшают продукцию факторов некроза опухолей; инъекции этого соединения индуцировали у мышей воспалительный процесс.

У P . aeruginosa был обнаружен аутоиндуктор иной природы – 2-гептил-3-гидроокси-4-хинолон (названный PQS). PQS частично регулирует экспрессию гена эластазы lasB вместе с двумя описанными выше QS системами. Для экспрессии PQS необходим белок LasR, а PQS, в свою очередь, активирует транскрипцию гена rhlI.

Таким образом, QS системы принимают участие в контроле вирулентности P . aeruginosa в сложной, иерархической сети регуляции.

При микроскопировании легких у больных кистозным фиброзом (CF) было обнаружено, что P . aeruginosa обитает там преимущественно в составе биопленок. Было показано, что клетки P . aeruginosa , несущие lasI мутацию, не формируют зрелых биопленок, образование биопленок останавливается на стадии микроколоний. Эти мутации могли быть комплементированы экзогенным добавлением аутоиндуктора 3OC12-HSL. Исследования, проведенные с P . aeruginosa , показали, что образование биопленок может быть важнейшим фактором колонизации легких этим патогеном.

Другая патогенная бактерия, у которой активно изучается роль QS в регуляции вирулентности, Burkholderia cepacia , содержит CepI-CepR QS систему, участвующую в регуляции факторов патогенности (экзопротеаза, сидерофоры). Синтез аутоиндукторов QS регуляции N-октаноил-гомосеринлактона (C8-HSL) и N-гексаноил-гомосеринлактона (C6-HSL) у этой бактерии очень слабый. Было показано. что в большинстве случаев у больных кистозным фиброзом легкие были инфицированы одновременно B . cepacia и P . aeruginosa . При этом межвидовая коммуникация между этими бактериями могла усиливать патогенность B . cepacia . Так, добавление культуральной жидкости P . aeruginosa к культурам B . cepacia приводило к существенному увеличению экзопротеазной активности и продукции сидерофоров. Это был первый пример, когда бактерия могла регулировать продукцию своих факторов патогенности за счет синтеза AI другой бактерией. Изучение подобных особенностей поведения бактерий в природных условиях открывает новые аспекты, важные для эпидемиологии. Действительно, в эпидемиологии не учитываются такие вполне возможные ситуации, когда взаимодействие непатогенных бактерий – продуцентов AHL и слабо патогенных бактерий (или практически непатогенных в данных условиях) может привести к развитию инфекции. Имеющиеся сейчас данные настоятельно ставят вопрос о необходимости серьезных исследований коммуникации различных бактерий в природных условиях и молекулярных механизмов подобной коммуникации.

QS у грамположительных бактерий

У грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности у Staphylococcus aureus , в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации) у Streptococcus pneumoniae , регуляции компетентности и споруляции у Bacillus subtilis . В качестве аутоиндукторов QS систем у грамположительных бактерий используются секретируемые пептиды, AIP. Среди них – линейные пептиды и пептиды, содержащие тиолактонное кольцо. Они узнаются специфическими рецепторами – двухкомпонентными, связанными с мембранами сенсорными гистидин-киназами. Пептидные сигнальные молекулы не диффундируют через клеточную мембрану; по-видимому, за выход их из клетки в среду ответственны экспортеры пептидов. При этом в большинстве случаев происходит процессирование и модификация пептидов. Различные грамположительные бактерии синтезируют различные пептидные сигнальные молекулы. Сигнальный механизм функционирует через каскад фосфорилирование/ дефосфорилирование. Сенсорная киназа фосфорилируется, после чего фосфорильная группа переносится на соответствующий белок - регулятор ответа. Фосфорилированный регулятор ответа связывается с ДНК и активирует транскрипцию гена-мишени.

Лучше всего изучена система QS у Staphylococcus aureus . S . aureus использует бифазную стратегию при инфекции макроорганизма. При низкой плотности популяции бактерий (первый этап инфекции) клетки продуцируют белковые факторы, способствующие их прикреплению и колонизации; при высокой плотности популяции (второй этап) бактерии репрессируют синтез этих факторов, и в них начинается секреция токсинов и протеаз; этот этап регулируется Agr QS системой. Система включает аутоиндуктор пептид AIP и agrBDCA -оперон. Ген agrD кодирует AIP, гены agrC и agrA - два двухкомпонентных белка, сенсор-киназы, AgrC и AgrA. Ген agrB кодирует белок, который экспортирует и модифицирует AIP (добавляет тиолактонное кольцо). Связывание AIP с AgrC приводит к фосфорилированию AgrA. Фосфорилированный AgrA индуцирует экспрессию регуляторной РНК (РНКIII), которая подавляет экспрессию факторов клеточной адгезии во время второго этапа инфекции. Активированный AgrA также индуцирует экспрессию agr оперона, что вызывает индукцию синтеза AIP.

Известны четыре группы S . aureus , синтезирующие AIP с различной последовательностью. Интересно, что каждый тип AIP активирует свой собственный рецептор AgrC, но ингибирует активацию рецепторных белков у трех остальных групп вследствие конкурентного связывания с этими белками; в результате, AIP каждой группы стафилококков подавляет активацию каскада вирулентности остальных трех групп S . aureus . В соответствии с такой стратегией, очищенный пептид AIP II группы стафилококков подавляет вирулентность S . aureus группы I при инфекции мышей.

Второй QS механизм, функционирующий в S . aureus , включает белок RAP (он же рибосомальный белок L2) и белок TRAP; последний является цитоплазматическим транскрипционным фактором. TRAP в фосфорилированном состоянии активирует РНК III; его фосфорилирование стимулируется белком RAP. Вирулентность S . aureus может ингибироваться пептидом RIP (RNA III inhibiting peptide). Пептид RIP ингибирует фосфорилирование белка TRAP, приводя к ингибированию синтеза РНК III, что приводит к подавлению синтеза токсина и снижению вирулентности клеток. Фосфорилирование TRAP может ингибироваться также в присутствии AIP; это показывает, что сложная сеть сигнальной трансдукции участвует в регуляции патогенеза S . aureus .

У других грамположительных бактерий, стрептомицетов, среди которых – основные продуценты антибиотических веществ, используемых в медицине, в качестве аутоиндукторов QS систем используются соединения иной природы - γ-бутиролактоны. QS у этих бактерий участвует в регуляции их морфологической дифференции и продукции вторичных метаболитов. Интересно, что сигнальные молекулы стрептомицетов структурно сходны с N-ацил0-гомосеринлактонами грамотрицательных бактерий. Неизвестно, однако, существует ли в природе коммуникация между этими таксономически далекими группами бактерий с использованием указанных сигнальных молекул.

QS система, использующая аутоиндуктор AI -2

Аутоиндуктор AI-2 был обнаружен впервые в клетках Vibrio harveyi ; это соединение с необычной структурой, фуранозил-борат диэфир. AI-2 накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, но содержание его резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу.

Синтазой AI-2 является белок LuxS, кодируемый геном luxS ; гены luxS высоко гомологичны у разных бактерий. Фактически, ген luxS присутствует в половине всех секвенированных бактериальных геномов.

AI-2 продуцируется из S-аденозилметионина через три стадии; субстратом для LuxS-синтазы является S-аденозил-гомоцистеин, который далее превращается в аденин, гомоцистеин и 4,5-дигидрокси-2,3-пентандион (DPD). Из DPD, весьма реактивного продукта, легко перестраивающегося и вступающего в дополнительные реакции, могут образовываться сигнальные молекулы, которые различные виды бактерий распознают как AI-2. Недавно была определена структура еще одной сигнальной молекулы AI-2 у Salmonella typhimurium ; это вещество фурановой природы отличается от AI-2 V . harveyi , в том числе, не содержит атома бора. Показано, что эти два AI-2 и их предшественники, образуемые из DPD, могут находиться в природных условиях в равновесии и легко взаимопревращаться. Предполагают, что появление бора в молекуле AI-2 V . harveyi может быть связано с высокой концентрацией этого элемента в морской воде, где обитает эта бактерия; в то же время его концентрация в условиях обитания S . typhimurium значительно ниже. Наличие бора в молекуле AI-2 V . harveyi и его отсутствие в AI-2 S . typhimurium , по-видимому, существенны для действия этих аутоиндукторов в клетках продуцирующих их организмов.

Таким образом, эти пока еще немногочисленные исследования QS систем, включающих аутоиндукторы типа AI-2, показали, что с помощью консервативного пути биосинтеза, использующего фермент LuxS, бактерии синтезируют интермедиаты сигнальных молекул, дальнейшая судьба которых может определяться особенностями окружающей среды.

У Vibrio harveyi рецепторным сенсорным белком является LuxP, непосредственно связывающий AI-2. Комплекс LuxP-AI-2 взаимодействует с мембранно-связанной гистидин-киназой LuxQ. При низких плотностях популяции бактерий LuxQ фосфорилируется, и фосфат переносится на цитоплазматический белок LuxU, а затем с этого белка на регуляторный белок LuxO, связывающийся с ДНК. Далее, происходит сложная цепь событий, включающих активацию генов, кодирующих пять маленьких регуляторных РНК, белком фосфо-LuxO и сигма 54 субъединицей РНК-полимеразы; эти РНК взаимодействуют с РНК-шапероном белком Hfq, что приводит к связыванию и дестабилизации мРНК, кодирующей активатор транскрипции LuxR. LuxR требуется для активации транскрипции lux оперона Vibrio harveyi ; при низких плотностях популяции бактерий мРНК luxR деградирует, и в результате биолюминесценция отсутствует. При высоких плотностях популяции бактерий количество AI-2 сильно возрастает, что приводит к дефосфорилированию белка LuxO. Нефосфорилированный LuxO не может индуцировать экспрессию маленьких регуляторных РНК. В результате становится возможной трансляция мРНК luxR , синтез белка LuxR и биолюминесценция. Таким образом, в конечном итоге накопление AI-2 вызывает активацию экспрессии генов lux оперона. Большой интерес представляет факт, что в регуляции lux оперона V . harveyi принимают участие три вида аутоиндукторов QS систем, взаимодействующих между собой: AI-2, AHL (таб.) и CAI-1.

В настоящее время вопрос о роли AI-2 как сигнальной молекулы и регулятора экспрессии генов у разных бактерий остается недостаточно изученным и требует дальнейших исследований.

В отношении патогенных бактерий на основании изучения мутантов с инактивированным геном lux S было показано, что этот ген, считающийся геном синтазы AI-2, участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью энтеропатогенных штаммов E . coli , Vibrio cholerae , Streptococcus pyogenes . QS системы этого типа являются глобальными регуляторами экспрессии бактериальных генов; так, было показано, что lux S участвует в регуляции транскрипции 242 генов E . coli , составляющих 5,6% генома этой бактерии.

Среди бактерий семейства Enterobacteriaceae наиболее хорошо изучены QS-системы II типа у E . coli и S . typhimurium . У S . typhimurium обнаружены гены, кодирующие тип рецептора AI-2, отличный от рецептора AI-2 LuxP у V . harveyi . Это АТФ-зависимый транспортер, названный LsrB (от LuxS-regulated). Такой же рецептор AI-2 был обнаружен и у других представителей семейства Enterobacteriaceae . Оказавшись внутри клетки, AI-2 фосфорилируется и связывается с белком LsrR. В отсутствие AI-2 белок LsrR репрессирует lsr оперон. AI-2 накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, содержание его в среде резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу. Клетки E . coli и S . typhimurium импортируют AI-2 при переходе в стационарную фазу с помощью транспортера Lsr .

На основании изучения эффекта мутаций, инактивирующих ген lux S, был сделан вывод о том, что синтаза LuxS участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью, у патогенных штаммов E . coli EHEC и EPEC - контролирует экспрессию системы секреции III типа, которую кодируют гены LEE-локуса, участвует в регуляции миграции клеток, формировании биопленок, в синтезе токсинов и др. Транскриптомный анализ показал, что LuxS является глобальным регулятором EHEC, контролируя экспрессию более 400 генов. Опубликовано большое количество данных, показывающих, что мутации в гене lux S приводят к отсутствию синтеза AI-2 и оказывают существенное влияние на клеточные процессы различных бактерий семейства Enterobacteriaceae : S . marcescens , Serratia sp . , Erwinia carotovora и amylovora .

Однако, в экспериментах по комплементации мутации в гене lux S при использовании выделенного и химически синтезированного AI-2 было установлено, что не все фенотипы, зависимые от lux S, контролируются непосредственно AI-2. Регуляторная роль AI-2 доказана точно для биолюминесценции штамма V . harveyi BB170 и экспрессии lsr -оперона у S . typhimurium . Эти результаты показали, что данные о влиянии AI-2 на некоторые свойства клеток, которые ранее считались зависимыми от QS системы II типа, должны быть пересмотрены с учётом того, что синтез AI-2 – это не единственная функция LuxS синтазы. В клетках бактерий с инактивированными генами lux S накапливается S-рибозил-гомоцистеин, так как не происходит его дальнейшее расщепление до гомоцистеина и DPD. В этом случае в клетке резко снижается уровень гомоцистеина, который необходим для синтеза метионина, и клетка будет использовать другие пути его образования, в частности, через оксалоацетат. Следовательно, изменение экспрессии различных генов у lux S-мутантов может определяться не (или не только) QS-регуляцией, но и серьезными нарушениями метаболизма бактерий, вызывающими плейотропные эффекты.

Чтобы ответить на вопрос, связано ли влияние lux S-мутантов на различные фенотипы бактерий с отсутствием функционирования QS-систем на основе AI-2, или это результат плейотропных эффектов при нарушении метаболизма, был проведен анализ геномных баз данных на наличие генов известных рецепторов AI-2 (LuxP-рецептора Vibrio harveyi и Lsr-рецептора S. typhimurium ) Было высказано предположение, что зависимость фенотипов от QS регуляции II типа ограничивается преимущественно организмами, несущими гены рецепторов AI-2, а изменение фенотипов у lux S мутантов, не содержащих эти гены, можно объяснить нарушениями в клеточном метаболизме. Геномный анализ позволил установить наличие Lsr-подобных рецепторов AI-2 у представителей семейства Enterobacteriaceae , таких как E . coli , Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae, Yersinia spp ., Shigella dysenteriae и Shigella flexneri , Salmonella spp .

Гомологи известных рецепторов AI-2 не обнаружены в опубликованных банках последовательностей генов и белков бактерий родов Serratia и Erwinia . Хотя и не было неожиданностью отсутствие двухкомпонентной сенсорной киназы LuxPQ (этот рецептор до сих пор был найден только у представителей семейства Vibrionaceae ), отсутствие в геноме этих бактерий и Lsr-рецепторного комплекса стало сюрпризом. Этот факт вызывает серьезные сомнения в существовании у них QS-систем, функционирующих с участием AI-2, и предполагает преимущественно метаболическую роль LuxS у этих бактерий. Хотя, конечно, нельзя исключить возможности наличия у них ещё не изученных рецепторов AI-2.

Таким образом, функции веществ типа AI-2 могут быть различными у разных бактерий. Однако, даже в тех случаях, когда эти вещества в составе QS систем не являются регуляторами экспрессии генов клетки-хозяина, они могут, выделяясь в среду, участвовать в регуляции клеточных процессов других бактерий в популяции, осуществляя их коммуникацию. Подобные взаимоотношения были показаны для искусственных смешанных популяций бактерий, состоящих из клеток E . coli и V . harveyi , а также V . cholerae , который может сосуществовать с E . coli в человеческом организме.

QS системы, использующие аутоиндуктор AI -3 и гормоны

AI-3 впервые был описан как компонент использованной культуральной среды штамма патогена EHEC, который активировал экспрессию генов, отвечающих за адгезию бактерий на эукариотических клетках. Эксперименты по изучению структуры AI-3 показали, что это соединение ароматической природы, высказано предположение об аминокислотной природе AI-3. Однако, полностью структура и механизм синтеза этой сигнальной молекулы еще не определены. Предполагается, что как и в случае АГЛ, имеется целое семейство соединений, подобных AI-3. Было показано, что синтез AI-3 не зависит от гена lux S в E . coli , в отличие от синтеза AI-2. Обнаружили, что АI-3 активирует транскрипцию генов вирулентности LEE-локуса у EHEC штаммов E . coli . Для определения АI-3 были получены биосенсоры - штаммы E . coli K-12, содержащие в хромосоме конструкции на основе генов LEE-локуса и гена репортера lac Z. С помощью биосенсоров было обнаружено, что различные бактерии кишечной микрофлоры, непатогенные штаммы E . coli и Enterobacter cloacae и патогенные виды Shigella , Salmonella и Klebsiella , синтезируют

Для функционирования AI-3 у E . coli необходима двухкомпонентная система, включающая сенсорную киназу QseC и регулятор ответа QseB. В присутствии в периплазматическом пространстве AI-3 QseC вначале фосфорилируется, затем переносит фосфат на QseB, который связывается с соответствующими промоторами и вызывает активацию экспрессии собственного гена и генов flhDC -оперона, отвечающего за синтез жгутиков . AI-3 также участвует в регуляции генов LEE-локуса . Обнаружена двухкомпонентная система, названная QseEF, ответственная за регуляцию этих генов.

QseCB и QseEF системы, кроме AI-3, отвечают на еще один класс сигнальных молекул – катехоламиновые гормоны, в частности, эпинефрин/норэпинефрин (или адреналин/норадреналин), синтезируемые организмом-хозяином. Анализ бактериальных геномов показал, что AI-3/эпинефрин/норэпинефрин сигнальные каскады присутствуют в большом количестве бактериальных видов.

QS и апоптоз у бактерий.

Кроме описанных выше QS систем, у E . coli обнаружена QS система, функционирующая с участием пептидов в качестве сигнальных молекул, которая участвует в регуляции апоптоза бактерий. Апоптоз или программируемая клеточная смерть (ПКС) - генетически обусловленная программа гибели клеток у многоклеточных эукариотических организмов. ПКС способствует нормальному функционированию биологической системы, освобождая ее от поврежденных, закончивших жизненный цикл или появившихся вследствие возникновения мутаций потенциально опасных клеток. Найдены системы со сходной функцией и у прокариот. Прокариотическим аналогом апоптоза можно считать гибель части клеточной популяции бактерий в условиях остановки роста популяции, например, в стационарной фазе роста при исчерпании питательного субстрата или под влиянием стрессовых факторов. В результате гибели и автолиза части клеток оставшиеся живые клетки могут использовать продукты автолиза как питательный субстрат и продолжать расти, синтезируя необходимые клеточные компоненты, что полезно для выживания бактериальных популяций. ПКС может способствовать обмену генетической информацией в популяции бактерий при высвобождении ДНК в результате лизиса клеток. Кроме того, уничтожение клеток с повреждениями генетического аппарата также полезно для популяции бактерий.

Генетические механизмы ПКС в прокариотических системах полностью не выяснены. Большое внимание было уделено изучению токсин-антитоксин систем (ТА-системы), обнаруженных у E. coli и других бактерий. ТА-модули состоят из пары генов в геномах бактерий: гена, кодирующего стабильный токсин, который вызывает гибель клеток, и гена, кодирующего лабильный антитоксин, который ингибирует активность токсинов; гены токсинов ко-транскрибируются с генами соответствующих антитоксинов в составе одного оперона.

Система E . coli maz EF является одной из наиболее изученных ТА-систем. Ген maz F кодирует стабильный цитотоксический белок, а maz E – нестабильный антитоксин, разрушаемый АТФ-зависимой ClpAP сериновой протеазой. Токсин MazF представляет собой эндорибонуклеазу, которая преимущественно расщепляет однонитевые мРНК в последовательности ACA и действует также на 16S РНК в декодирующем центре 30S субьединицы рибосомы, что приводит к ингибированию синтеза белка. До тех пор, пока MazE и MazF экспрессируются совместно, MazE взаимодействует с MazF, нейтрализуя его токсичное действие. В нормально растущих клетках токсин и антитоксин образуют стабильный комплекс, что мешает токсину осуществлять токсическое действие. В стрессовых условиях, которые препятствуют экспрессии maz EF-оперона, индуцированные стрессом протеазы разрушают MazE, и в результате стабильный токсин MazF может действовать на клеточные РНК, что приводит к гибели клеток и автолизу большей части популяции.

maz EF-опосредованный апоптоз зависит от плотности популяции, он регулируется QS-фактором EDF (extracellular death factor, внеклеточный фактор смерти). EDF является линейным пентапептидом Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. Было установлено, что EDF увеличивает активность MazF in vitro . В то же время, активация MazF приводила к увеличению синтеза EDF, что в свою очередь вызывало увеличение гибели клеток в стрессовых условиях. Было обнаружено прямое сайт-специфическое связывание EDF и MazF. Результаты проведенных исследований показывают, что QS система, участвующая в регуляции апоптоза у E . coli , кардинально отличается от описанных выше QS систем Enterobacteriaceae : 1) EDF – единственная сигнальная молекула пептидной природы, обнаруженная у E . coli ; 2) большинство известных молекул, участвующих в функционировании QS, контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции, а EDF – на посттранскрипционном уровне.

Недавно были обнаружены несколько небольших QS-пептидов, отличающихся по последовательности аминокислот от EDF, синтезируемых грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa и грамположительной Bacillus subtilis , которые могли участвовать в регуляции клеточной гибели, управляемой maz EF . Каждый из этих пептидов, несмотря на различия в строении, активировал эндорибонуклеолитическую активность MazF E . coli , по-видимому, взаимодействуя с различными сайтами этого белка. Таким образом, была обнаружена семья QS пептидов EDF, которая в дальнейшем может стать основой для получения регуляторов нового типа, активирующих ПКС.

Приведенные выше QS системы и участвующие в их функционировании аутоиндукторы не исчерпывают всех известных в настоящее время; число вновь открываемых постоянно увеличивается.

Ингибирование QS систем бактерий - новый подход к созданию лекарств против патогенности

Одной из важнейших проблем современной медицины является все большее распространение бактериальных возбудителей, устойчивых к традиционным лекарственным препаратам. Особенно ярко эта проблема иллюстрируется широким распространением госпитальных инфекций, которые регистрируются сейчас в отделениях интенсивной терапии более чем у 20% пациентов. Распространение устойчивых к лекарственным препаратам форм патогенных бактерий, снижающее эффективность и обесцениваюшее все большее количество обычно применяемых традиционных лекарственных средств, и необходимость разработки способов подавления образования бактериями биопленок ставит вопрос о новых стратегиях для борьбы с инфекционными заболеваниями, о создании лекарственных средств нового поколения, воздействующих на специфические биохимические системы микроорганизмов.

В настоящее время принято считать, что одной из наиболее перспективных «мишеней» подобного рода является Quorum Sensing регуляция. QS системы, как было отмечено выше, участвуют в регуляции вирулентности бактерий и формировании ими биопленок.

Лекарственные средства, направленные на подавление QS систем, предложено называть «ядами патогенности», т.к. они, в отличие от классических антимикробных лекарств (прежде всего, антибиотиков), не обладают бактерицидным или бактериостатическим действием на патогенные бактерии и поэтому не создают селективного давления, ведущего к образованию резистентных к антибактериальным веществам форм патогенных бактерий. В последнее время за рубежом образованы биотехнологические компании, которые ставят своей целью разработку средств, ингибирующих QS регуляцию и, вследствие этого, снижающих патогенность бактерий и предотвращающих образование ими биопленок.

Подавление функционирования QS систем может быть достигнуто несколькими способами.

1. Подавление синтеза аутоиндукторов QS систем.

Как упоминалось выше, S-аденозилметионин (SAM) является субстратом для синтеза аутоиндукторов AHL и AI-2 QS систем двух типов. Показано, что различные аналоги SAM, например, S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин действовали, как сильные ингибиторы синтеза AHL у Pseudomonas aeruginosa . Следует отметить при этом, что взаимодействие AHL-синтазы с SAM, по-видимому, происходит очень специфично, несмотря на то, что SAM является обычным предшественником во многих прокариотических и эукариотических биохимических путях. Это позволяет надеяться, что аналоги SAM могут быть использованы как специфические ингибиторы синтеза аутоиндукторов бактериальных QS систем регуляции, не влияющие на ферменты эукариотов.

Показано, что некоторые антибиотики – макролиды, ингибиторы синтеза белка на рибосомальном уровне, подавляли синтез AHL и некоторых факторов вирулентности в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий. Например, субингибирующие концентрации эритромицина подавляли синтез AHL и факторов вирулентности гемолизина, протеаз, гемагглютининов у Pseudomonas aeruginosa . Бактерии, подвергнутые действию антибиотика, были менее вирулентны для мышей. Эти данные согласовывались с результатами клинических наблюдений, показавших эффективность применения низких доз эритромицина и других макролидов при инфекциях, вызванных штаммами P . aeruginosa , резистентных к этим антибиотикам. Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующей рост P . aeruginosa , подавлял синтез AHL, а также продукцию факторов вирулентности эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру AHL экзогенно приводило к восстановлению продукции этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез AHL являлся первичной мишенью действия антибиотика. Механизм действия антибиотиков – макролидов на синтез AHL остается в настоящее время неясным

2. Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими

регуляторными белками .

Подавление функционирования QS систем регуляции может быть достигнуто с помощью молекул антагонистов аутоиндукторов, которые мешают связыванию AI с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут быть конкурентными AHL – в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле аутоиндуктора и связываются с сайтом связывания AHL с рецепторным белком, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут иметь слабое сходство с AHL, или вообще быть несходными с ним; эти соединения связываются с различными сайтами на рецепторном белке. В настоящее время подобные ингибиторы активно изучаются; поиск конкурентных ингибиторов проводится с использованием компьютерного дизайна.

Получены данные о ингибировании QS регуляции аналогами AHL, несущими модификации в различных частях молекул AHL – в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце. Было показано, что длина ацильной цепи имеет существенное значение для активности AHL. Аналоги AHL с более длинными ацильными цепями, чем у нативных AHL, могли быть ингибиторами активности QS систем. Замена в молекулах AHL 3-оксо-групп на 3-гидроксильные или метильные, введение ненасыщенных связей в ацильные цепи приводит к значительному снижению активности AHL .

Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул AHL существенно влияют на их активность. Природные AHL являются l-изомерами; d-изомеры, в основном, биологической активности не проявляют. Наличие ацильной цепи, по-видимому, необходимо для биологической активности AHL. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное уменьшало активность AI на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводило к отсутствию активирующих или антагонистических свойств у этой молекулы. Однако, молекулы, в которых гомосеринлактон заменен на гомосеринтиолактон, могут сохранять активность при функционировании некоторых QS систем.

При изучении действия аналогов AHL Las системы P . aeruginosa с заменами в гомосеринлактонном кольце было показано, что отношение к этим заменам было различным в случае взаимодействия этих аналогов с RhlR и LasR белками. Этот факт может указывать, что два рецепторных белка P . aeruginosa отличаются существенно в

их сайтах связывания с AHL .

В последнее время большое внимание уделяется природным антагонистам QS аутоиндукторов, производным фуранонов, в том числе, галогенизированным. Было обнаружено, что австралийская красная водоросль Delisea pulchra синтезирует различные виды галогенизированных фуранонов; их продукция препятствует колонизации этой водоросли морскими бактериями, у которых QS система участвует в регуляции метаболических процессов, и, таким образом, защищает растения от действия бактерий. Фураноны D . pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в C-3 положении ацильной цепью и атомами брома в C-4 положении. Замещения в C-5 положении могут варьировать. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомами брома, иода или хлора.

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D . pulchra , в различных лабораториях был проведен широкий скрининг веществ природного происхождения и получение химически синтезированных веществ, производных фуранонов, ингибиторов QS. Среди них были производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Было показано, что даже производное фуранона без ацильной цепи с двумя атомами брома было ингибитором QS системы P . aeruginosa . Было обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и др..

Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с AHL за сайт связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с белком – рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка.

Действие фуранонов в результате приводило к ингибированию клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibrio fischeri ; продукции факторов вирулентности, включая образование биопленок, и патогенеза P . aeruginosa ; вирулентности Erwinia carotovora . Многие химически синтезированные фураноны были значительно эффективнее, чем природные. Представляет большой интерес факт, что синтетические фураноны были активны против бактерий в составе биопленок в тех же концентрациях, что и против QS регуляции планктонно размножающихся бактерий, в отличие от действия классических антибиотиков, используемых для борьбы с инфекциями P . aeruginosa ; в последнем случае концентрация антибиотика при росте бактерий в биопленках должна была быть в 100-1000 раз выше.

Использование транскриптомного анализа позволило определить, что добавление к клеткам соединений фураноновой природы влияет на экспрессию 93 генов P . aeruginosa PAO1; функционирование 80% этих генов регулировалось с участием QS систем, например, гены, кодирующие эластазу, протеазу LasA, участвующие в синтезе рамнолипидов, феназинов, цианида, хитиназы.

Недавно было показано, что производное фуранона, продуцируемое водорослью D . pulchra , (5Z)-4-бромо-5-(бромометилен)-3-бутил-2(5H)-фуранон, ингибировало QS в клетках Escherichia coli с участием аутоиндуктора AI-2; это соединение подавляло также формирование биопленки и вызывало репрессию 56 генов E . coli , 79% которых индуцировалось AI-2. При действии указанного соединения внеклеточная концентрация AI-2 уменьшалась вдвое; предполагается, что этот эффект осуществлялся на посттранскрипционном уровне.

Приведенные выше данные показывают, что производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако, испытанные в настоящее время соединения с ингибирующим QS регуляцию действием токсичны для применения в медицине. Актуальной задачей является их модификация и поиски новых, нетоксичных веществ для применения на практике.

Бактерии и эукариотические организмы продуцируют вещества иной природы, подавляющие QS регуляцию у бактерий – циклические дипептиды (дикетопиперазины); о них упоминалось выше как о соединениях, способных активировать QS систему. Предполагают, что они также взаимодействуют с сайтами связывания AHL с рецепторными белками.

3. Деградация AHL .

Деградация аутоиндукторов QS систем – один из перспективных путей борьбы с бактериальными инфекциями, регулируемыми этими системами. Разложение AHL может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов; кроме того, они могут разлагаться в результате щелочного гидролиза, при высоких pH, при повышенной температуре выращивания бактерий. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих AHL, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо.

Лактоназы, гидролизующие AHL, были найдены у бацилл; соответствующий белок был назван AiiA. Было показано, что присутствие этого фермента в клетках бактерий определяет в значительной степени их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS системами с участием AHL. Перенос гена рекомбинантной AHL-лактоназы в клетки Pseudomonas fluorescens увеличивал способность штамма к биоконтролю заболеваний растений, вызванных фитопатогенными бактериями. Более того, было показано, что трансгенные растения, содержащие введенный ген aiiA , экспрессирующийся в растении, были существенно менее чувствительны к инфекции Erwinia carotovora . Введение гена aiiA в клетки этого фитопатогена снижало синтез AHL и в результате уменьшало активность пектолитических ферментов и проявление других симптомов гнили растений. Исследуется также потенциал AHL-ацилаз, продуцируемых бактериями, в деградации AHL .

Высшие организмы также обнаруживают механизмы специфической деградации AHL. Большой интерес представляют данные о том, что клетки эпителия дыхательных путей человека способны инактивировать AHL P . aeruginosa – 3OC12HSL, но не C4-HSL. Эта инактивация имеет, по-видимому, энзиматическую природу. Деградации подвергаются и другие AHL, например, C6-HSL. Способность к деградации AHL обнаружена у некоторых, но не у всех, клеток млекопитающих. Эта находка открывает новую область исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций – через взаимодействие с QS регуляцией вирулентности бактерий.

Поиск и изучение ферментов, деградирующих аутоиндукторы QS систем – новый перспективный путь получения терапевтических агентов, направленных на борьбу с бактериальными инфекциями.

4. Подавление QS систем грамположительных бактерий.

Вирулентность Staphylococcus aureus , контролируемая QS системами, может ингибироваться природными RIP пептидами, их химически синтезированными аналогами и химерными пептидами. Эти пептиды конкурируют с пептидом RAP, ингибируя фосфорилирование белка TRAP, и в результате подавляют синтез РНКIII, что приводит к ингибированию вирулентности бактерии. Отмечено, что пептиды RIP ингибировали in vivo образование биопленок S . aureus и S . epidermidis . Эффективность пептидов показана при использовании в качестве модели различных животных, инфицированных S . aureus . Использование одновременно RIP пептидов и антибиотиков обеспечивало синергидный эффект, приводя к 100% выживания мышей, инфицированных S . aureus . Возможно также использование ингибиторного действия AIP на QS S . aureus , о чем было сказано выше.

Полученные данные подтверждают потенциальную возможность использования пептидов, взаимодействующих с QS системами стафилококков, для борьбы с клиническими инфекциями, вызываемыми этими бактериями. Еще один подход для антибактериальной терапии грамположительных бактерий – вакцинирование организма белками – компонентами QS системы. Например, было показано, что вакцинация мышей белком RAP защищала их против инфекции S . aureus .

Заключение

Интенсивные исследования Quorum Sensing регуляции, проведенные в последние годы, показали, что QS системы осуществляют глобальную регуляцию большого количества клеточных процессов у бактерий различных таксономических групп. Этот тип регуляции, по-видимому, широко распространен у бактерий. Обнаружен широкий спектр низкомолекулярных регуляторов с различной структурой, вовлеченных в процессы QS регуляции; количество выявленных соединений с подобной активностью возрастает. QS регуляция, безусловно, требует детальных и глубоких исследований. Мало изучены молекулярные механизмы функционирования QS систем различных типов; во многих случаях не выяснено, какие свойства бактерий контролируются этими регуляторами; QS системы и их роль в метаболизме бактерий исследованы лишь для небольшого количества бактерий.

В последнее время было показано, что ауторегуляторы QS систем функционируют не только в бактериях - обнаружено их влияние на клеточные процессы и в эукариотических организмах. Выше отмечалось непосредственное влияние 3OC12-HSL (AHL, участвующий в регуляции вирулентности P . aeruginosa ) на некоторые свойства клеток млекопитающих. Было обнаружено, что растительный организм (Medicago truncatula ) способен отвечать на бактериальные AHL (3OC12-HSL и 3OC16-HSL, продуцируемые соответственно патогеном P . aeruginosa и симбионтом растения Sinorhizobium meliloti ). С помощью метода протеомики было определено, что эти AHL вызывают глобальные изменения в продукции более 150 растительных белков. Кроме того, они индуцировали секрецию растениями веществ, которые могли взаимодействовать с QS регуляцией бактерий – ингибировать или стимулировать QS .

По-видимому, эукариотические организмы, растения и животные, в процессе эволюции приобрели способность узнавать QS сигналы и отвечать на них, продуцируя вещества, сходные структурно с этими сигнальными молекулами и являющиеся их конкурентами, а также синтезируя ферменты, разрушающие эти сигнальные молекулы. Эукариоты могут использовать природные стратегии терапии, направленные против колонизации и инвазии патогенных бактерий, в результате ингибирования процессов, управляемых QS.

Выше сказанное свидетельствует о том, что изучение систем QS регуляции представляет новое обширное поле деятельности для исследователей в различных областях биологии и медицины; это явление заслуживает самого пристального внимания исследователей. Выявление и изучение QS систем различных микроорганизмов может открыть много нового в регуляции клеточных процессов.

Особое внимание уделяется изучению участия QS-систем в регуляции процессов, связанных с патогенностью бактерий. Как было показано выше, существенная роль QS в регуляции синтеза факторов вирулентности у бактерий открывает возможность принципиально нового подхода к созданию лекарственных средств для антибактериальной терапии – лекарств, направленных непосредственно на подавление QS регуляции и, вследствие этого, подавлению патогенности бактерий. В настоящее время проводятся интенсивные скрининг и исследования действия различных веществ, полученных из природных источников и в результате химического синтеза, на QS регуляцию и экспрессию генов, связанных с QS. Обнаружено взаимодействие с QS веществ, относящихся к полифенолам; т.к. полифенолы широко распространены в растительном царстве, предполагается, что они могут быть важны для защиты растений от патогенных бактерий. Показано, что целый ряд веществ, продуцируемых растениями, способны взаимодействовать с QS системами; природа этих веществ изучается.

В настоящее время есть все основания полагать, что лекарственные средства, осуществляющие ингибирование QS, могут быть многообещающей альтернативой традиционным лекарственным средствам антибактериальной терапии для медицины, сельского хозяйства, пищевых технологий. Или, по крайней мере, они смогут усиливать антимикробное действие используемых препаратов. Работы в этом направлении активно проводятся во многих лабораториях и компаниях в разных странах мира.

Глава 2. Кворум сенсинг

2.1. Общая характеристика и механизм кворум сенсинга

Система межклеточной коммуникации у микроорганизмов носит название системы quorum sensing (QS ). Сегодня система QS определяется как система координированной экспрессии генов в популяции, зависящая от показателя её плотности, с использованием малых сигнальных молекул. Как уже отмечалось выше, этот механизм был впервые описан в 1970 году Нильсоном у морской бактерии Vibrio fisheri в качестве системы регуляции биолюминисценции. Изначально предполагалось, что данный механизм регуляции свойственен лишь небольшому числу близкородственных видов рода Vibrio , однако дальнейшие исследования показали широкую распространённость этого механизма регуляции в мире микроорганизмов . Было обнаружено, что с помощью системы QS микроорганизмы способны регулировать многие процессы жизнедеятельности, в частности патогенность, вторичный метаболизм, формирование биоплёнки и многое другое. Было показано, что система QS встречается не только у бактерий, но и у некоторых низших эукариот, таких как дрожжеподобные грибы родов Candida и Cryptococcus . Более того, оказалось, что с помощью этой системы микроорганизмы способны взаимодействовать не только с себе подобными, но и осуществлять межцарственную коммуникацию, в том числе и с высшими эукариотами.

В общем случае функционирование системы QS базируется на ряде ключевых принципов (рис. 1):

Использование малых сигнальных молекул – в системе QS передача сигнала от одной клетке к другой осуществляется с помощью сигнальных молекул различной химической природы.
Наличие специфических рецепторов – сигнальные молекулы не влияют на экспрессию генов-мишеней на прямую. Активация генов-мишеней происходит лишь после связывания сигнальных молекул с соответствующими рецепторами.
Влияние плотности популяции клеток – запуск системы QS осуществляется лишь по достижении определённого значения плотности популяции клеток, коррелирующей с концентрацией сигнальных молекул во внешней среде.
Самоподдержание функционирования – контроль синтеза новых сигнальных молекул и рецепторов осуществляется так же, как и генов- мишеней в отсутствии активации систем репрессии.
Наличие механизмов избирательной негативной регуляции – в клетках микроорганизмов имеются как зависимые, так и не зависимые от QS гены негативной регуляции, продукты которых способны избирательно отключать целые звенья системы QS или всю систему в целом.

Рис. 1. Общая схема функционирования системы quorum sensing.

Данные принципы являются общими практически для всех типов систем QS не зависимо от их конкретной структурной организации. Запуск системы QS обычно совпадает по времени с ранней стадией экспоненциального роста, для которой является характерным быстрый рост плотности популяции клеток. Экспрессия генов-мишеней же напротив обычно начинается с выходом популяции клеток в стационарную фазу, и обычно является комплексной, то есть, предполагает начало биосинтеза практически всех регулируемых с помощью QS продуктов в короткий промежуток времени. Таким образом, ранние этапы работы системы QS заключаются в. обеспечении биосинтеза сигнальных молекул и рецепторов к ним, до определённого момента, совпадающего с накоплением максимальной концентрации сигнальных молекул в межклеточном пространстве, по достижению которой работа системы QS переходит в самоподдерживающееся состояние.

Механизмы, лежащие в основе ранней активации системы QS, на сегодня окончательно не выяснены. Не смотря на то, что обнаружено большое количество различных регуляторов, которым приписывается определённая роль в ранней активации системы , многие вопросы остаются не решёнными. Прежде всего, не ясно, каким образом регулируется первичное накопление сигнальных молекул и рецепторов к ним. Существует гипотеза о том, что определённое количество сигнальных молекул и рецепторов к ним присутствует в клетках постоянно, и первичное их накопление происходит по тому же самоподдерживающемуся механизму, при этом на синтез сигнальных молекул и рецепторов расходуется часть внутриклеточного пула этих соединений. Остальная же часть выводится из клеток и по достижении пороговой концентрации реабсорбируется и запускает экспрессию генов-мишеней. Однако, исходя из особенностей функционирования некоторых типов системы QS, подобное видится маловероятным. James P. Pearson, напротив, считает что первичный запуск QS осуществляется с помощью неспецифических регуляторов транскрипции таких как MvaT и Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa , и система переходит в самоподдерживающееся состояние значительно позднее.

2.2. Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов

Грамположительные бактерии обычно осуществляют коммуникации, используя олигопептидные сигнальные молекулы. Передача сигналов в большинстве случаев включает двухкомпонентный механизм фосфорилирования. Как правило, состояние кворума достигается при переходе популяции бактериальных клеток в стационарную фазу роста. Именно в это время обнаруживаются сигнальные молекулы, при помощи которых клетки контактируют друг с другом. Общую схему коммуникаций грамположительных бактерий можно представить следующим образом: сначала в клетке синтезируется предшественник, который, модифицируясь, превращается в зрелый олигопептид. Последний экскретируется наружу клетки экспортером. Молекулы олигопептида накапливаются в межклеточном пространстве по мере того, как растёт плотность бактериальных клеток. Двухкомпонентная сенсорная киназа, пронизывающая мембрану, распознает сигнал и осуществляет его передачу в клетку в процессе каскадного фосфорилирования. В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым геном (генами).

Классической пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему, отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов. Эта система стимулирует распространение в микробной популяции признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также для устранения конкуренции. Переносимая пептидной кворум-зависимой системой плазмида pPDl отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCDl - за образование бактериоцина, плазмида pCFlO - за устойчивость E.faecalis к тетрациклину. Каждый гекса- или октапептид индуцирует слипание бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определенной плазмиды. Например, октапептид cPDl стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPDl. Плазмида кодирует рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Взаимодействие олигопептида с рецептором вызывает диссоциацию репрессора от ДНК, тем самым запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPDl включает также ген traC, продуктом которого является белок, облегчающий проникновение пептида через клеточную стенку. Олигопептидные сигналы интенсивно синтезируются клетками, не несущими соответствующие плазмиды (реципиентами), в то время как у клеток-доноров синтез таких сигналов подавлен, более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид.

Продуктом плазмиды pPDl является пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Другим кворум-зависимым процессом, обнаруженным у E.faecalis , является выработка двух вирулентных факторов: желатиназы (GelE) и сериновой протеазы (SprE).

Примером использования пептидного сигнала для осуществления межклеточных взаимодействий может служить система кворум-сенсинга, осуществляющая контроль над синтезом экзотоксинов в поздней логарифмической фазе роста у Staphylococcus aureus . В этой системе белок AgrD синтезируется в виде предшественника, состоящего из 46 аминокислот, который в процессе экспорта белком AgrB превращается в зрелый пептид AIP (autoinducing peptide), состоящий из 8 аминокислот. AIP распознается двухкомпонентной сенсорной киназой AgrC, которая передает сигнал внутрь клетки в процессе фосфорилирования регулятора ответа - AgrA. AgrA~P активирует транскрипцию целевых генов, стимулирует транскрипцию оперона agrB, D, С, А (положительная ауторегуляторная петля), а также «запрещает» транскрипцию генов, кодирующих другие экзотоксины. На основании различий в AIP и его рецепторе штаммы S.aureus могут быть отнесены к четырём или более группам. Олигопептиды, синтезируемые одной из групп, индуцируют патогенность в этой группе и специфически подавляют системы Agr-вирулентности в других группах.

От плотности популяции зависит появление компетентности в поздней логарифмической фазе роста у Streptococcus pneumoniae . Ген соmС кодирует предшественник, состоящий из 41 аминокислотного остатка. Последний преобразуется в зрелый пептид, состоящий из 17 аминокислотных остатков в процессе взаимодействия с системой экспорта пептидов (АВС-система), которую образуют продукты генов соmАВ. Пептид контактирует со своим рецептором на поверхности клетки - гистидинкиназой, продуктом гена comD. Активированная гистидинкиназа фосфорилирует продукт гена соmЕ. По мере накопления клеток количество пептидных сигналов растёт и достигает в среде критического уровня. Соответственно увеличивается и количество фосфорилированного белка cоmЕ, который, начиная с определенной концентрации, связывается с промотором оперона comCDE, стимулируя его работу (положительная ауторегуляторная петля), активирует промотор оперона соmАВ (система экспорта белка из клетки), активирует оперон сотХ, который включает целую цепочку поздних генов компетентности; отвечающих за связывание и поглощение трансформирующей ДНК и все остальные, поздние стадии трансформации.

В добавление к приведённым примерам реакций кворум-сенсинга у грамположительных бактерий нужно отметить, что в качестве сигнальных молекул помимо олигопептидов грамположительными бактериями также используются вещества другой химической природы. Так, у представителей порядка Actinomycetales наряду с пептидными сигнальными молекулами были обнаружены вещества низкомолекулярной природы, большинство из которых содержит лактонную группировку.

У стрептомицетов в системы кворум-сенсинга вовлечены бутиролактоны и соответствующие им белковые рецепторы, которые совместно регулируют морфологическое развитие и образование антибиотиков у их продуцентов . Наиболее хорошо изученным актиномицетным регулятором является А-фактор, представляющий собой 2-изо-каприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.

Влияние А-фактора на морфологическую дифференцировку и антибиотикообразование подчиняется общей схеме работы стрептомицетных регуляторов, содержащих лактонную группировку. На ранних стадиях роста, когда концентрация А-фактора низка, рецептор А-фактора (АгрА) связывается и репрессирует экспрессию общего гипотетического активатора биосинтеза стрептомицина и спорообразования. При выделении АгрА из клеточного лизата S.griseus IFO 13350 было показано, что этот белок состоит из 276 аминокислот и имеет молекулярную массу 29,1 кДа.

Когда плотность культуры возрастает, концентрация А-фактора достигает критического уровня, при котором он связывает АгрА, вызывая диссоциацию последнего от ДНК и, таким образом включая транскрипцию ключевого гена adpA, кодирующего AdpA (белок, состоящий из 405 аминокислот, содержащий в центральном участке сайт связывания с ДНК, схожий с регуляторами транскрипции из семейства белков AraC/XylS). AdpA, в свою очередь, является позитивным регулятором обнаруженного цитоплазматического активатора кластера генов биосинтеза стрептомицина и активаторов процесса спорообразования. Цитоплазматический активатор, связываясь с ДНК в районе промотора гена специфической регуляции кластера биосинтеза стрептомицина strR, индуцирует транскрипцию данного гена, расположенного вслед за ним гена устойчивости к собственному антибиотику - aphD, гена adsA, кодирующего экстрацитоплазматический а-фактор РНК-полимеразы, необходимой для формирования воздушного мицелия, а также гена sgmA, кодирующего белок-пептидазу, участвующую наряду с другими гидролитическими ферментами в деградации белков субстратного мицелия в результате формирования воздушного мицелия. Регуляторный продукт гена strR обусловливает начало транскрипции структурных генов биосинтеза в составе кластера с StrR-зависимых промоторов. Начало экспрессии с промотора strR гена под влиянием цитоплазматического активатора обеспечивает также наработку продукта гена aphD - аминогликозидфосфотрансферазы, и тем самым создание базового уровня устойчивости штамма к собственному антибиотику.

Показано, что у разных видов стрептомицетов наблюдается гомология между структурными элементами регуляторов. Нуклеотидные последовательности, гомологичные гену агрА у S.griseus , обнаружены также у других стрептомицетов. Например, у S.coelicolor A3 (2) было обнаружено два гена сргА и сргВ, кодирующих АгрА-подобные белки СргА и СргВ, которые на 90,7% сходны между собой и на 35% - с АгрА.

Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) - это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном.

На конкретный клеточный сигнал клетки в популяции отвечают специфическим ответом. На сегодняшний день установлено, что клеточно-клеточные взаимосвязи влияют на внутрипопуляционную дифференцировку клеток, на экспрессию генов вирулентности, регулируют ростовые процессы, характер и направление подвижности (таксис), а также бактериальный апоптоз и токсинообразование.

Работу QS можно сравнить с гормональной регуляцией функциональной активности различных органов и тканей в многоклеточном организме.

Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы используют различные сигнальные системы и разные химические передатчики сигналов. Первые синтезируют 7-8-членные пептиды (Enterococcus spp.), циклопептиды (Staphylococcus spp.); вторые: разнообразные ацил-гомосерин лактоны (AHL).

Рассмотрим работу QS на примере синегнойной палочки. У данного микроорганизма функционируют, по меньшей мере, три регуляторные системы. Наиболее изученная из них LasI - LasR система (в качестве химического сигнала выступают AHL с длинной ацильной цепью); RhlI - RhlR система (мессенджер - AHL c короткой ацильной цепью, C4-HSL); и хинолоновая PQS система. Взаимодействие этих трех систем позволяет регулировать экспрессию порядка 6-10% генома. В LasI - LasR системе за биосинтез сигнальных молекул отвечает AHL-синтаза, продукт гена lasI. Его экспрессия находится на базальном уровне, поэтому накопление сигнальных молекул происходит достаточно длительно, и биологический эффект начинает проявляться только в стационарной фазе роста популяции. В клетках AHL взаимодействует с LasR-белком (продукт lasR-гена, экспрессия которого также находится на базальном уровне), образуя при этом гомодимер - регулятор транскрипции. Этот регулятор активирует множество генов, участвующих в формировании вирулентности, и в процессах образования биопленок, он также активирует хромосомный регулон las Box, который отвечает за экспрессию различных факторов патогенности (протеазы, эластаза, и прочее). Комплекс LasR + AHL активирует вторую сигнальную систему. Это происходит после взаимодействия с промотором Rhl-генов. Экспрессия RhlI обусловливает образование протеина для синтеза AHL с короткими ацильными остатками (C4-HSL). Ген rhlR кодирует белок (RhlR), который взаимодействует с сигнальными молекулами C4-HSL. Образующийся протеиновый тандем RhlR + C4-HSL регулирует транскрипцию генов, кодирующих различные структурные соединения матрикса биопленок (альгината, рамнолипида и др.), а также липазы, пиоцианина. Также этот транскрипционный регулятор активирует экспрессию другого регулятора - RpoS (сигма-фактор стационарной фазы роста P.aeruginosa), который инициирует образование стрессовых белков клетки и участвует в адаптационных реакциях. Среди клинических изолятов P.aeruginosa обнаружено, что помимо функционирования AHL-сигнальных систем, параллельно вступает хинолоновая система (генный локус - pqsABCDE), мессенджерами являются гидроксиалкилхинолоны и гидроксигептилхинолоны. Эта система функционирует так же, как и вышеописанные механизмы регуляции, и опосредует увеличение экспрессии факторов вирулентности, в частности, синтез эластазы, лектинов. Взаимодействие трех сигнальных систем затрагивает большое количество генов, в связи с чем происходит глобальная регуляция транскрипции, что приводит к очень гибкой лабильности физиологических процессов клетки, и является следствием огромного адаптационного потенциала бактерий в популяции.

Сигнальные системы работают по принципу аутоиндукции, синтезированные сигнальные молекулы действуют на свою же клетку, и по мере их накопления во внеклеточной среде происходит все большая активация зависимых промоторов, регулонов генома клеток. QS на основе AHL обнаружен у многих грамотрицательных бактерий: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia и др.. AHL-коммуникация осуществляется внутри вида, специфичность и сила биологического ответа зависит от химической структуры самой сигнальной молекулы.

Но среди клинических изолятов грамотрицательных бактерий часто наблюдается и перекрестная коммуникация (cross - talk communication), обеспечивающая взаимодействие популяций разных видов в инфекционном очаге. Перекрестный QS способен как активировать, так и ингибировать работу зависимых целевых генов в бактериальных ассоциациях. Например, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila синтезируют один тип сигнальных молекул. QS C.violaceum и A.hydrophila ингибируется AHL-молекулами с длинными ацильными остатками, которые синтезируются различными грамотрицательными микроорганизмами. Синегнойная палочка образует сигнальные молекулы с длинными и короткими ацильными остатками, и они взаимно не ингибируются, однако, мессенджеры E.coli такой же молекулярной структуры с длинными ацильными остатками способны ингибировать rhl-сигнальную систему P.aeruginosa. В смешанных биопленках P.aeruginosa и Burkholderia cepacia, буркхолдерии реагируют на сигналы синегнойной палочки (которая в свою очередь не чувствительна к сигналам B.cepacia), следовательно, популяция P.aeruginosa регулирует многие физиологические процессы своего ассоцианта. Имеются данные, что некоторые штаммы P.aeruginosa, выделенные от больных исцидозом, не способны сами синтезировать аутоиндукторы rhl-сигнальной системы, следствием чего является снижение вирулентности, и неполноценное формирование биопленок в опытах in vitro. Но, однако, in vivo, эти же штаммы синегнойной палочки формируют полноценные биопленки. Выяснено, что микрофлора, выделенная из слизи от тех же больных, синтезирует rhl-аутоиндукторы, регулируя таким образом вирулентность и формирование биопленок P.aeruginosa и инициируя инфекционный процесс. Сами AHL-молекулы неодинаково влияют на другие группы бактерий, установлено например, что аутоиндукторы синегнойной палочки блокируют работу QS у S.aureus. Сигнальные молекулы прокариот способны влиять и на поведение клеток грибов, растений, и даже животных клеток. Так, AHL P.aeruginosa подавляет процесс филаментации Candida albicans.

В организме человека AHL-молекулы ингибируют пролиферацию лейкоцитов и процесс образования фактора некроза опухолей б. В высоких концентрациях AHL инициируют апоптоз разных типов иммунокомпетентных клеток. В целом, бактериальные аутоиндукторы оказывают иммуносупрессирующее действие. Именно за счет реакций QS осуществляются «социальные» отношения внутри популяции, образуется «химическая коммуникационная сеть» биопленки, которая может охватывать мультиводовое сообщество.

Не менее интересна работа сигнальных систем среди грамположительных микроорганизмов. Например, у Enterococcus spp. QS регулирует процесс переноса плазмид (от донорной к реципиентной клетке) через механизм конъюгации. Клетка-реципиент синтезирует специфический пептидный сигнал («половой» бактериальный феромон) который накапливается в среде и специфически связывается с рецепторами клеток-доноров, несущими плазмиду, которая соответствует этому феромону. Запускаемая при этом регуляторная система обеспечивает экспрессию факторов, опосредующих клеточное взаимодействие и перенос плазмиды (компоненты конъюгации). Как отмечалось выше, определенной плазмиде соответствует конкретный феромон. За счет такого строгого механизма взаимодействия осуществляется бактериальная селекция клеток внутри биопленки. Посредством такой коммуникации траслоцируются плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов. Обычно биологически активные сигнальные пептиды закодированы в хромосоме, а рецепторные белки, обеспечивающие аффинитет к феромонам закодированы в самих плазмидах. После транслокации плазмиды в клетку реципиента, она начинает синтез ингибиторов феромонов, для каждого типа феромона соответствует свой ингибитор. Это свойство позволяет выключать сигнал для уже имеющейся плазмиды, и усиливать накопление молекул феромонов для другого типа плазмид. биоплёнка микроорганизм клетка

За счет работы подобной системы в популяции биопленки постоянно происходит положительная селекция штаммов с выгодными свойствами и отрицательная селекция - элиминация штаммов, с «ненужными» фенотипами. При инфекционных поражениях такие коммуникативные механизмы передачи мобильных генетических элементов позволяют с максимальной скоростью распространять гены антибиотикорезистентности, вирулентности, дополнительные физиологические возможности.

Наибольший интерес представляет QS, участвующий в регуляции экспрессии факторов вирулентности у стафилококков. Генетической основой работы этой системы является agrABCD - хромосомный локус. В качестве передатчиков сигналов выступают циклопептиды - аутоиндукторы (AIP, auto-inducing peptide), которые классифицированы по строению и биологическому эффекту на группы и субгруппы, например, 1 и 4 субгруппы у S.aureus увеличивают экспрессию факторов вирулентности. Эти молекулы крайне специфичны, замена хоты бы одной аминокислоты в структуре соединения, ведет к потере биологической функции. Как и с примерами сигнальной - ингибиторной системы у энтерококков, стафилококковая система реагирует только на один тип аутоиндукторов, как только клетка получила специфический сигнал, активируются гены-ингибиторы, и клетка уже не способна воспринимать другие сигналы. Такой механизм обеспечивает жесткую популяционную селекцию. Синтезированные сигнальные молекулы взаимодействуют с гистидинкиназной мембранной системой (agrC), которая через каскад реакций активирует регулятор транскрипции (agrA). Этот белок осуществляет бифункциональную регуляцию двух промоторов P2 и P3. Соответственно, транскриптами этих зависимых генов является РНК II и РНК III, первая содержит основные agr-гены, таким образом проявляется аутоиндуктивный ответ системы. В свою очередь РНК III обеспечивает регуляцию синтеза факторов вирулентности (ДНКазы, фибринолизина, энтеротоксина, б-, в-, д-токсинов и др.). Интересной особенностью на данном этапе регуляции является то, что транскрипт РНК III размером в 500 пар нуклеотидов не несет кодируемой информации, за исключением одной открытой рамки считывания для д-токсина. Подавляющая часть молекулы транскрипта сама выступает как рибосомальный ингибитор. РНК III блокирует процесс трансляции фактора репрессии вирулентности Rot (repressor of toxins), регулирующий синтез стафилококковых токсинов, следствием чего является неконтролируемое образование экзотоксинов. Таким образом, agr-система обеспечивает популяционную регуляцию экспрессии факторов вирулентности стафилококков. Используя различные варианты ПЦР-исследований, установлено, что экспрессия agr-локуса в клетках наблюдается при многих стафилококковых поражениях: инфекции кожи, эндокардиты, артриты, сепсис. В популяции биопленок накапливаются сигнальные молекулы, синтезируемые подавляющим большинством клеток, являющихся метаболическим и генетическим «ядром, кворумом» популяции, они задают метаболическое поведение, фенотипические изменения для всех клеток. Это осуществляется за счет аккумуляции сигналов через свойство аутоиндукции, и ингибирование других сигналов, синтезируемыми меньшинством, либо вообще иными штаммами в биопленке за счет параллельного механизма ингибирования. 1.5.Клиническое значение биоплёнок.

Представления о биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили взгляды на инфекционные заболевания. Все новые данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, а фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток.

Существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их диагностике и лечению. Кроме того, традиционные бактериологические методы не выявляют большинство бактерий, участвующих в инфекционном процессе. Новейшие молекулярные, геномные, транскрипционные и протеомные методы позволили определить, что при выделении чистой культуры определяется лишь около 1% клеток патогенного микробиоценоза. В результате лечение нацелено лишь на 1-2 вида бактерий из множества штаммов, присутствующих в составе биопленки (в том числе, возможно, и грибов).

К настоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как инфекции, связанные с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и другими грамположительными микроорганизмами; инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками; пародонтит, обусловленный рядом микроорганизмов полости рта; инфекции мочевых путей, определяемые Е. coli и др. патогенами; инфекции среднего уха -- причина, например, Haemophilus influenzae, муковисцидоз, вызываемый P. Aeruginosa и др.

Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов. Далеко не до конца ясны механизмы, по которым микроорганизмы, образующие биопленки, вызывают патологические процессы в макроорганизме.

Кроме тканей организма хозяина, микробные биопленки колонизируют различные медицинские устройства небиологической природы, внедряемые в организм человека (катетеры, водители ритма, сердечные клапаны, ортопедические устройства). Исследования имплантированных медицинских устройств с применением электронной микроскопии показали присутствие бактериальных биопленок.

Возрастающая антибиотикорезистентность и развитие бактериальных биопленок являются основными проблемами в лечении инфекций мочевых путей.

Установлено, что в основе повышенной устойчивости лежат свойства клеток и внеклеточного матрикса. Матрикс биопленки может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики. Устойчивость, обусловленную свойствами клеток биопленки, объясняют уменьшением их свободной поверхности за счет контактов друг с другом и формированием особых бактерий, получивших название персистеров.

Персистеры это альтруистические клетки, которые образуются в стационарной фазе роста, они метаболически не активны и обеспечивают выживание материнской популяции в присутствии летальных, для всех клеток, факторов. В биопленках эта субпопуляция составляет 1-5% от всей клеточной массы. Формирование таких клеток зависит от степени роста популяции, в лог-фазе культура не образует или образует очень небольшую долю персистеров, их количество увеличивается к стационарной фазе. Образование субпопуляции обратно зависимо от уровня метаболической активности всех клеток биопленки, а также от действия экзогенных неблагоприятных факторов. Фенотип персистеров характеризуется интересной биологией, они замедляют все физиологические процессы и становятся толерантными к действию разных факторов, в том числе и к воздействию антимикробных препаратов.

Свойство антибиотикотолерантности отличается от механизмов резистентности. Действиевсех механизмов устойчивости бактерий, по существу, можно свести к одному явлению - это предотвращение взаимодействия антибиотика с его мишенью (за счет изменений самих мишеней, или с помощью синтеза ферментов, нейтрализующих антибиотики). Толерантность же опосредуется способностью микробной клетки выживать в присутствии антибиотика за счет замедления метаболизма и «выключения» основных биологических процессов клетки.

Основными же механизмами повышения устойчивости бактерий к антибиотикам в биопленках являются:

1. ограничение проникновения антибиотиков через биопленки;

2. ограничение питания и измененная микросреда в биопленке приводят к уменьшению скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков;

3. адаптивные реакции;

4. генная изменчивость у персистирующих в биопленке бактерий.

Исходя из накопившихся данных, следует, что антибиотики по действию набактерии биопленок разделяются на два типа. К первому относят антибиотики, проникающие в биопленки и угнетающие или убивающие образующие их микроорганизмы. Второй тип -- антибиотики, практически не проникающие в биопленки, но эффективно препятствующие их расселению за счет мигрирующих бактерий. Таким образом, некоторые антибиотики не проникают в биопленки и не уничтожают существующие сообщества, а только препятствуют увеличению их числа и распространению в организме человека. В связи с этим в последние годы началось изучение способности антибиотиков проникать в биопленки различных микробов.

Установлено, что в биопленки Klebsiella pneumoniae плохо проникает ампициллин, а в сообщества Enterococcus faecalis -- ампициллин, ко-тримаксозол и ванкомицин. В биопленки ряда микробов плохо проникает широко используемый амоксициллин.

К числу антибиотиков, хорошо проникающих через липиды клеток, относятся фторхинолоны. Эта группа антимикробных препаратов способна действовать на основные возбудители урологических заболеваний, в достаточной концентрации проникает в очаг инфекции. Имеющийся опыт использования антибиотиков свидетельствует, что с инфекционным процессом, прежде всего с его клиническими проявлениями, можно справиться с помощью антибиотиков, как проникающих, так и не проникающих в биопленки. Однако разница между ними существует, и она достаточно существенна. Показано, что различия антибиотиков, проникающих и непроникающих в биопленки, могут проявляться в отдаленных результатах лечения. Использование антибиотиков, плохо проникающих в биопленку, очень быстро приводит к формированию и отбору устойчивых штаммов. Кроме того, при этом чаще возникают рецидивы и формируются очаги хронических процессов.

Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия.

«Антибиотики и химиотерапия», 2003, 48 (10): 32-39.

Статья размещена с любезного разрешения Ефременковой Ольги
Владимировны, зав. сектором поиска природных соединений
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Коммуникативные сигналы бактерий

В.Д. Грузина

Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва

V.D. Gruzina. Bacteria Communicative Signals

G.F. Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания.

Колонии практически всех видов бактерий демонстрируют способность к клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта способность наиболее очевидно проявляется при росте бактерий в их природных местах обитания, где они формируют различные многоклеточные структуры: биоплёнки, бактериальные маты, плодовые тела и др.

Понятие «ощущение кворума» (Quorum Sensing) было предложено в 1994 году. Оно означает восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения.

К числу описанных процессов, протекающих лишь при достаточно высокой плотности популяции, относятся следующие явления:

биолюминесценция у морских бактерий Vibrio fisheri и V.harveyi ;
агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со спорами;
споруляция у бацилл и актиномицетов;
стимуляция роста у стрептококков и ряда других микроорганизмов;
конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а также у бактерий рода Agrobacterium ;
синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у патогенов растений (Erwinia carotovora , E.hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus );
образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у E.carotovora ;
формирование биоплёнок у Р.aeruginosa и других микроорганизмов.

Раскрыты механизмы многих из указанных процессов, определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности популяции.

Серьёзной проблемой клинической практики является широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибактериальных препаратов. Особенную трудность представляет повышенная лекарственная устойчивость бактерий в биоплёнках. Для синтеза факторов вирулентности, антибиотиков и формирования биоплёнок бактерии часто используют реакции кворум-сенсинга. Поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.

Механизмы реакций кворум-сенсинга различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий, поэтому целесообразно их рассмотрение в отдельности.

Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов

Продуктом плазмиды pPDl является пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

У стрептомицетов в системы кворум-сенсинга вовлечены бутиролактоны и соответствующие им белковые рецепторы, которые совместно регулируют морфологическое развитие и образование антибиотиков у их продуцентов. Наиболее хорошо изученным актиномицетным регулятором является А-фактор, представляющий собой 2-изо-каприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.

Реакции кворум-сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов

Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворум-зависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные ацилгомосеринлактоны. Общую схему коммуникаций грамотрицательных бактерий можно представить следующим образом: в системе кворум-сенсинга грамотрицательных бактерий белки семейства Luxl являются аутоиндукторными синтазами и катализируют формирование специфических ацилгомосеринлактонных аутоиндукторных молекул. Аутоиндукторы свободно диффундируют через мембрану и аккумулируются по мере увеличения плотности клеток. Белки семейства LuxR связывают родственные им аутоиндукторы при достижении достаточно высокой концентрации сигнальных молекул. Комплекс LuxR - аутоиндуктор связывается с промотором целевых генов, запуская их транскрипцию.

Бактерии рода Erwinia (E.carotovora , E.chrysanthemii ) - патогены для растений. Они расщепляют растительные клеточные стенки с помощью пектиназ и целлюлаз. Образование этих ферментов является важным фактором вирулентности и зависит от плотности популяции. У Erwinia функционирует генная система expI-expR, аналогичная системе luxI-luxR у V.fisheri . В реакциях кворум-сенсинга также задействована регуляторная система, обеспечиваемая транскрипцией генов rsmA-rsmB. От плотности популяции у E.carotovora зависит также синтез антибиотика карбапенема. Продукция этого антибиотика находится под контролем кластера генов сагА-сагН, и, возможно, необходима для устранения конкурирующих микроорганизмов в локусе заражения растения.

Другой пример использования в качестве сигнальных молекул гомосеринлактонов показан для Pseudomonas aeruginosa - патогена для животных. Патогенность у Р.aeruginosa обусловлена широким арсеналом факторов вирулентности. Одни из них ассоциированы с клеткой (пили, адгезины, липополисахариды), другие секретируются (протеазы, рамнолипиды, экзофермент S, экзотоксин А, антибиотик пиоцианин и т. д.). Образование многих из внеклеточных факторов вирулентности контролируется системами межклеточного взаимодействия. Центральными компонентами таких взаимодействий служат las- и rhl-системы кворум-сенсинга, активирующие экспрессию генов в зависимости от величины плотности клеток микроорганизма. Каждая система представлена двумя генами: один кодирует фермент, при помощи которого синтезируется специфический аутоиндуктор - ацилированный гомосеринлактон (lasl/rhll); другой кодирует активатор транскрипции, с которым связывается соответствующий аутоиндуктор (lasR/rhIR). Аутоиндуктором систем las и rhi является N-(3-оксододеканоил)-L-гомосеринлактон (З-оксо-С12-HSL), для экспорта которого из клетки служит специальная система, получившая название MexEF-OprN-помпа и N-бутирил-L-гомосеринлактон (C4-HSL) соответственно.

Система las контролирует экспрессию генов, кодирующих такие факторы вирулентности, как эластазы А, В, а также щелочную протеазу; система rhi - ферменты биосинтеза рамнолипидов, пиоцианина. Недавно была обнаружена третья сигнальная молекула, принимающая участие в реакциях кворум-сенсинга у P.aeruginosa - 2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон (PQS). Эта сигнальная молекула может контролировать уровень экспрессии las В, кодирующего эластазу Las В, а также уровень экспрессии rhil, кодирующего синтазу C4-HSL.

Бактерия Agrobacterium tumefaciens вызывает образование корончатых галлов у многих видов растений. Галлы представляют собой растительный аналог злокачественной опухоли и образуются в результате переноса онкогенных фрагментов ДНК от бактерии в ядро растительной клетки посредством Ti-плазмид. Некоторые из генов Ti-плазмид обусловливают синтез растительными клетками опинов, которые служат питательным субстратом для A.tumefaciens . Гомологичная luxI-luxR генная система traI-traR стимулирует распространение Ti-плазмид в бактериальной популяции. Плазмидная ДНК стремится распространиться в популяции бактерий и, как только создается достаточный «кворум», побуждает несущие плазмиду клетки конъюгировать с другими бактериальными клетками. В то же время конъюгативный перенос Ti-плазмид зависит от опинов. В частности, транскрипция traR стимулируется фактором OccR, активируемым октопином.

Кворум-сенсинг в многоклеточных образованиях

Способность бактерий образовывать биоплёнки интересна ввиду того, что представители патогенных для человека и животных возбудителей проявляют устойчивость к действию антимикробных веществ при их росте в биоплёнках. Биоплёнки - высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. Биоплёнки могут состоять из одного или нескольких видов бактерий. Их пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма. В одной биоплёнке можно наблюдать различные образцы генной экспрессии, что говорит о том, что индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности», которые, комбинируясь с другими, усиливают жизнеспособность всего консорциума.

Биоплёнки формируются в лёгких патогенным микроорганизмом P.aeruginosa . Толщина такой биоплёнки составляет несколько сотен микрометров. Микроколонии в зрелой биоплёнке расположены во внеклеточном полисахаридном матриксе. Внутри биоплёнки обнаруживается неоднородность: в ней существует кислородный градиент - уменьшение концентрации кислорода от периферии вглубь. Предполагается, что сходные градиенты будут обнаружены для рН и питательных веществ. Эти градиенты обеспечивают физиологическую вариабельность среди индивидуальных клеток биоплёнки: так, в глубине клетки растут гораздо медленнее, чем на периферии. Бактерия в такой зрелой биоплёнке фенотипически устойчива к бактерицидным агентам. Таким образом, биоплёнки вызывают различные типы хронических бактериальных инфекций. Формирование биоплёнки у P.aeruginosa находится под контролем реакций кворум-сенсинга. Мутации гена lasI нарушает созревание биоплёнки, так как белок LasI не синтезирует 3-oкco-C12-HSL, и после стадии микроколонии формирование микропленки не продолжается. Роль C4-HSL в процессах формирования остаётся неизвестной. Биоплёнки, образуемые мутантами по LasI-белку, восприимчивы к детергентам, в то время как нормальные биоплёнки устойчивы. Это дает повод думать, что терапия, нацеленная на нарушение регуляции механизма кворум-сенсинга у P.aeruginosa , может привести к остановке формирования биоплёнки, что повысит чувствительность этой бактерии к антимикробным агентам.

Формирование биоплёнки у патогенной бактерии Burkholderia cepacia также определяется «чувством кворума». При росте в биоплёнках данный микроорганизм подобно P.aeruginosa обнаруживает значительную устойчивость к антимикробным агентам.

Межвидовые взаимодействия микроорганизмов

Межвидовые коммуникации у бактерий могут служить для синхронизации специализированных функций видов в группе. Разнообразие, присутствующее в каждой данной популяции, может повышать выживаемость для всего сообщества. Более того, продуктивные взаимодействия на основе кворум-сенсинга могут способствовать развитию многовидовых бактериальных организаций, таких, как биоплёнки, а также установлению специфических симбиотических ассоциаций с хозяевами - эукариотами.

Межвидовые взаимодействия микроорганизмов наиболее полно изучены на примере микробного сообщества ротовой полости и поверхности зубов человека. В биоплёнках на поверхности зубов выявлено около 500 видов бактерий, которые функционируют как координированное сообщество, имеющее внутри- и межвидовые коммуникации. Стрептококки составляют от 60 до 90% бактерий, которые колонизируют поверхность зубов в течение первых четырёх часов после ее очистки стоматологом. Среди других видов «ранних колонизаторов» обнаруживаются представители Actinomyces , Capnocytophaga , Eikenella , Haemophilus , Prevotella , Propionibacterium и Veillonella .

Способы коммуникаций среди генетически идентичных клеток, по всей вероятности, отличаются от сигналов при межвидовых коммуникациях. Нет доказательств наличия среди сигнальных молекул бактерий ротовой полости типичных представителей семейства ацилгомосеринлактонов, которые регулируют внутривидовую генную экспрессию у грамотрицательных бактерий.

Главной сигнальной молекулой при межвидовых коммуникациях является AI-2. Подтверждением этому является факт обнаружения гена luxS, кодирующего фермент, необходимый для синтеза молекулы AI-2, у нескольких родов бактерий ротовой полости.

AI-2 впервые был обнаружен у морской светящейся бактерии Vibrio harveyi , для которой он является сигнальной молекулой, регулирующей процесс биолюминесценции. Позже наличие AI-2 было показано более чем у 30 видов бактерий, включающих грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Иногда для одной группы бактерий может быть полезным негативно влиять на цикл реакций кворум-сенсинга конкурирующей группы бактерий. Исследования в этой области выявляют несколько примеров стратегий антикворум-сенсинга, которые используют сосуществующие популяции бактерий. Так, Staphylococcus epidermidis использует пептид для контроля уровня своей agr вирулентности, а также для подавления вирулентности у Staphylococcus aureus .

Штамм Bacillus sp. 240B1 демонстрирует способность к энзиматической инактивации ацилгомосеринлактонов - сигнальных молекул грамотрицательных бактерий. Было показано, что в присутствии АИА, гомосеринлактоназы, состоящей из 250 аминокислот, разрушаются молекулы гомосеринлактонов, продуцируемых патогеном у растений Erwinia сагоtovora . Гены, гомологичные гену аiiА, обнаружены и у 16 подвидов Bacillus thuringiensis , следовательно, данные микроорганизмы также способны осуществлять деградацию гомосеринлактонов.

Почвенная бактерия Variovorax paradoxus может использовать ацилгомосеринлактоны в качестве единственного источника углерода и азота. Этот факт указывает на то, что в своих природных местах обитания V.paradoxus может расти на ацилгомосеринлактонах, извлекая выгоду из конкурентного обострения в окружающей среде. В данном случае фермент, разрушающий ацилгомосеринлактоны, отличен от AiiA-лактоназы: это - аминоацилаза, отщепляющая лактонное кольцо от ацильной группы.

По причине того, что у многих патогенов животных и растений системы кворум-сенсинга контролируют вирулентность, эти системы можно рассматривать как потенциальные мишени для действия антимикробных агентов. Во-первых, одна из стратегий состоит в ингибировании синтеза молекул - предшественников ацилгомосеринлактонов или самих ацилгомосеринлактонов. Во-вторых, мишенью лекарственных препаратов могут служить системы, контролирующие выброс и диффузию ацилгомосеринлактонов. В-третьих, ацилгомосеринлактон-подобные антагонисты могут конкурировать с ацилгомосеринлактонами за связывание с гомологами LuxR. В-четвертых, возможно применение ферментов, расщепляющих ацилгомосеринлактоны, а также антител к этим молекулам. И, наконец, как было показано недавно, гены аiiА, кодирующие лактоназы, осуществляющие деградацию ацилгомосеринлактонов, могут быть внедрены в геном растений, экспрессируясь в котором, они могли бы обеспечивать защиту растению-хозяину от патогенных микроорганизмов. Так, трансгенные растения табака с включенным аiiА-геном успешно противостояли заражению E.carotovora .

Бактериальные цитокины

Обнаружено, что прокариотические микроорганизмы синтезируют вещества, похожие на гормоны позвоночных (включая стероиды и полипептидные гормоны, такие, как инсулин). Увеличивается количество данных, подчеркивающих важность химически опосредованных межклеточных взаимодействий в бактериальных культурах для таких событий, как споруляция, конъюгация, вирулентность и биолюминесценция. Таким образом, в настоящее время многие исследования в области микробиологии посвящены взаимодействиям между микроорганизмами, основанными на использовании бактериальных цитокинов.

Известно, что микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды (в частности, к недостатку питательных компонентов). При этом некоторые из них обладают генетически закреплённой специфической организацией метаболизма, позволяющей существовать при очень низких концентрациях питательных веществ (олиготрофы). Клетки другой категории (копиотрофы) при истощении среды обитания способны включать специальные программы переживания неблагоприятных условий. Часть из них образуют специализированные структуры (споры и цисты), которые чрезвычайно устойчивы к различным стрессам, неспорулирующие же бактерии способны переживать неблагоприятные условия, оставаясь вегетативными клетками с пониженной метаболической активностью, т.е. переходя в особое VBNC (viable but nonculturable - жизнеспособные, но некультивируемые) состояние. Естественно, что некультивируемые бактерии остаются за рамками общепринятых методов исследований (высевы на плотные или жидкие среды не позволяют их обнаруживать). Например, возбудители таких опасных заболеваний, как холера и кампилобактериоз, склонны образовывать некультивируемые формы. При микроскопическом исследовании образцов, выделенных из окружающей среды (почва, речные и морские воды и т.д.) обнаружено множество клеток, которые, обладая метаболической активностью, не могут образовывать полноценную культуру (т.е. некультивируемые). В настоящее время известно всего несколько примеров превращения таких бактерий в нормальные культивируемые клетки. Концепция цитокин-зависимого роста микроорганизмов позволяет по-новому рассматривать проблему подбора сред для восстановления некультивируемых форм.

Некультивируемые формы патогенных бактерий обнаружены не только в окружающей среде, но и в тканях, органах человека и животных. Чаще всего они сильно отличаются морфологически и биохимически. Например, возбудитель туберкулёза в тканях образует нетипичные кокковидные формы. Возможно, такие клетки являются особыми переживающими формами, способными к активации и размножению. Существование таких покоящихся форм может объяснить периодически возникающие рецидивы болезни у, казалось бы, вылеченных больных. Показано, что клетки Mycobacterium tuberculosis могут переходить в нереплицируемое кокковидное состояние в микроаэрофильных условиях in vitro , которые часто возникают in vivo (например, в гранулемах). Кокковидные формы также обнаружены для Campylobacter jejuni и Helicobacter pylori . Предполагается, что они образуются в тканях в ответ на воздействие лекарств и, возможно, являются покоящимися клетками, устойчивыми к действию антибиотиков. Однако данные о культивировании таких форм весьма противоречивы. Возможно, такие бактерии могут быть активированы какими-то специфическими ростовыми факторами, роль которых, вероятно, исполняют цитокины хозяина. Например, рост туберкулёзных бацилл внутри моноцитов существенно стимулировался трансформирующим ростовым фактором (TGF-1), тогда как рост клеток М.tuberculosis и M.avium внутри макрофагов значительно ускорялся в присутствии эпидермадьного ростового фактора. Очевидно, цитокинные факторы хозяина могут играть важную роль и в активации покоящихся бактерий, и в размножении активных возбудителей. Снижение уровня инсулина в крови больных сахарным диабетом приводит к значительному размножению клеток Pseudomonas pseudomallei , являющихся возбудителями мелиоидоза, а трансферрин имеет большое значение для роста и переживания внутри мышиных макрофагов клеток Francisella tularensis .

Возможно, что специфические бактериальные цитокины также играют существенную роль в образовании покоящихся форм и их восстановлении в активные делящиеся клетки. Тогда, принимая во внимание проблемы возникновения устойчивости к антибиотикам, сложно переоценить важность отыскания автокринных ростовых факторов, необходимых для роста патогенных бактерий, и, следовательно, являющихся мишенью для воздействия принципиально новых антибиотиков, нетоксичных для больного.

Применение специфических бактериальных цитокинов также может существенно улучшить ситуацию с выращиванием некультивируемых бактерий в средах, не вполне подходящих для их размножения. Например, обычно не растущие на минимальной сукцинатной среде микрококки начинают нормально в ней размножаться в присутствии автокринного фактора Rpf (resuscitation-promoting factor), а отмытые клетки Mycobacterium smegmatis , которые растут на минимальной среде только при добавлении Rpf, выделенного из Micrococcus luteus , можно рассматривать в качестве модели популяции «голодающих» бактерий в почве, вероятно, требующей для начала деления присутствия специфического цитокина. Применение специфических бактериальных цитокинов также может существенно улучшить ситуацию с выращиванием некультивируемых бактерий в средах, не вполне подходящих для их размножения. Гены, имеющие сходство с геном, кодирующим белок Rpf у М.luteus , широко распространены среди грамположительных бактерий с высоким содержанием G+C, к которым относятся стрептомицеты, коринебактерии и микобактерии. Этот факт открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.

Последнее обновление: 20.02.2004

ЛИТЕРАТУРА

Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов. Микробиология 2000; 69: 3: 309-327.
Fuqua W.С., Winans S., Greenberg Е. Quorum sensing in bacteria: the Lux R-Lux I family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 1994; 176: 2: 269-275.
Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev 1991; 55:1:123-142.
Winans S.С., Bassler В.L. Mob psychology. J Bacteriol 2002; 184: 4: 873-883.
Writh R., Muscholl A., Wanner G. The role of pheromones in bacterial interactions. Trends Microbiol 1996; 4: 3: 96-103.
Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: 1988;270.
Waldburger С., Gonzalez D., Chambliss G.H. Characterization of a new sporulation factor in Bacillus subtilis. J Bacteriol 1993; 175: 6321-6327.
Pestova E., Havarstein L., Morrison D. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto-induced peptide pheromones and a two-component regulatory systems. Mol Microbiol 1996; 21:4: 853-862.
Alloing G., Martin В., Granadel G., Claveris J. Development of competence in Streptococcus pneumoniae : pheromone autoinduction and control of quorum-sensing by the oligopeptide permease. Ibid 1998; 9:1: 75-83.
Прозоров А.А. Феромоны компетентности у бактерий. Микробиология 2001; 70: 1:5-14.
Salmond G., Bycroft В., Stewart С., Williams P. The bacterial «enigma»: cracking the code of cell-cell communication. Mol Microbiol 1995; 16:4:615-624.
Greenberg E., Winans S., Fuqua C. Quorum-sensing by bacteria. Ann Rev Microbiol 1996; 50: 727-751.
Otto M., Sussmuth R., Vuong C. et al. Inhibition of virulence factor expression in Staphylococcus aureus by the Staphylococcus epidermidis agr pheromone and derivatives. FEBS Lett. 1999; 450: 257-262.
Dong Y., Xu J., Li X., Zhang L. AiiA, an enzyme that inactivates the acyl-homoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovoru . Proc Natl Acad Sci 2000; 97:7: 3526-3531.
Byers J., Lucas C., Salmond G., Welch М. Nonenzymatic turnover of an Erwinia carotovora quorum-sensing signaling molecule. J Bacteriol 2002; 184:4: 1163-1171.
Calfee М., Coleman J., Pesci E. Interference with Pseudomonas quinolone signal synthesis inhibits virulence factor expression by Pseudomonas aeruginosa . Proc Natl Acad Sci 2001; 98: 20:11633-11637.
Nakayama J., Takanami Y., Horii T. et al. Molecular mechanism of pep-tide-specific pheromone signaling in Enterococcus faecalis : functions of pheromone receptor TraA and pheromone-binding protein TraC encoded by plasmid pPDI. J Bacteriol 1998: 180: 3: 449-456.
Mylonakis E., Engelbert М., Qin X. et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infect Immun 2002; 70: 8: 4678-4681.
Sifri C., Mylonakis E., Singh V. et al. Virulence effect of Enterococcus faecalis protease genes and the quorum-sensing locust in Caenorhabditis elegans and mice. Ibid 2002; 70:10: 5647-5650.
Matson М., Armitage J., Hoch J., Macnab R. Bacterial locomotion and signal transduction. J Bacteriol 1998; 180: 5: 1009-1022.
Onaka H., Horinouchi S. DNA-binding activity of the A-factor receptor protein and its recognition DNA sequences. Mol Microbiol 1997; 24: 991-1000.
Onaka H., Ando N., Nihira Т., Yamada Y. et al. Cloning and characterisation of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus . J Bacteriol 1995; 177: 21: 6083-6092.
Ohnishi Y., Kameyama S., Onaka H., Horinouchi S. The A-factor regulatory cascade leading to streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus : identification of a target gene of the A-factor receptor. Mol Microbiol 1999; 34: 102-111.
Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. An A-factor-dependent extracytoplasmatic function sigma factor (OAdsA) that is essential for morphological development in Streptomyces griseus . J Bacteriol 2000; 182:16:4596- 4605.
Kato J., Suzuki A., Yamazaki H. et al. Control by A-factor of a metalloendopeptidase gene involved in aerial mycelium formation in Streptomyces griseus . Ibid 2002; 184: 21: 6016-6025.
Onaka H., Nikagawa Т., Horinouchi S. Involvement of two A-factor receptor homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) in the regulation of secondary metabolism and morphogenesis. Mol. Microbiol. 1998; 28:4: 743-753.
Revenchon S., Bouillant М., Salmond G., Nasser W. Integration of the quorum-sensing system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemii . Mol Microbiol 1998; 29: 1407-1418.
Chatterjee A., Cui Y., Chatterjee A.K. RsmA and the quorum-sensing signal, N--L-homoserine lactone, control the levels of rsmB RNA in Erwinia carotovora subsp. carotovora by affecting its stability. J Bacteriol 2002; 184:15: 4089-4095.
Kohler Т., Van Delden C., Curty L. et al. Overexpression of the MexEF-OprN multidrug efflux system affects cell-to-cell signaling in Pseudomonas aeruginosa . Ibid 2001; 183: 18: 5213-5222.
Gallagher L., McKnight S., Kuznetsova М. el al. Functions required for extracellular quinolone signaling by Pseudomonas aeruginosa . Ibid 2002; 184:23:6472-6480.
Parsek М., Greenberg P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms. Proc Natl Acad Sci 2000; 97: 16: 8789-8793.
Conway В.А., Уепи V., Speert D. Biofilm formation and acyl-homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex. J Bacteriol 2002; 184:20:5678-5685.
Kolenbrander P., Andersen R., Blehert D. et al. Communication among oral bacteria. Microb. Molecular Biology Rev 2002; 66: 3: 486-505.
Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001; 55: 165-199.
Frias J., Olle E., Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules. Infect Immun 2001; 69: 3431-3434.
McNab R., Ford S., EI-Sabaeny A. et al. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii : Autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm formation with Porphyromonas gingivalis . J Bacteriol 2003; 185: 1:274-284.
Bassler В., Wright M., Silverman M. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi : sequence and function of genes encoding a second sensory pathway. Mol Microbiol 1994; 13: 273-286.
Ji G., Beavis R., Novick R. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants. Science 1997; 276: 2027-2030.
Lee S., Park S., Lee J., et al. Genes encoding the N-acyi homoserine lactone-degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillus thuringiensis . Appl Environ Microbiol 2002; 68: 8: 3919-3924.
Leadbetter J., Greenberg E. Metabolism of acylhomoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus . J Bacteriol 2000; 182:6921-6926.
Hoang Т., Schweizer H. Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoyl-acyl carrier protein reductase (Fabl): a target for the antimicrobial triclosan and its role in acylated homoserine lactone synthesis. Ibid 1999; 181:. 5489-5497.
Pearson J., Delden C., Iglewski B. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals. J. Bacteriol. 1999; 181: 1203-1210.
Manefield M., Welch M., Givskov G. et al. Halogenated furanoses from the red alga, Delisea pulchra, inhibit carbapenem antibiotic synthesis and exoenzyme virulence factor production in the phytopatoge Erwinia carotovora . FEMS Microbiol Lett 2001; 205: 131-138.
Dong Y., Wang L., Xu J. et al. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature. 2001; 411:813-817.
Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Цитокины - возможные активаторы роста патогенных бактерий. Вести РАМН 2000; 1: 13-17.
Barcina I., Lebaron P., Vives-Rego J. Survival of allochthonous bacteria in aquatic systems: a biological approach. FEMS Microbiol Ecol 1997; 23:1-9.
Heim S., Lleo M., Bonato B. et al. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis , as determined by proteome analysis. J Bacteriol 2002; 184:23: 6739-6745.
Xu H., Roberts N., Singleton F. el al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microb Ecol 1982; 8: 313-323.
Kell D., Kaprelyants A., Grafen A. Pheromones, social-behavior and the functions of secondary metabolism in bacteria. Trends In Ecology & Evolution 1995; 10: 126-129.
Domingue G., Woody H. Bacterial persistence and expression of disease. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 320-328.
Khomenko A. The variability of Mycobacterium tuberculosis in patients with cavitary pulmonary tuberculosis in the course of chemotherapy. Tubercle Lung Disease 1987; 68: 243-253.
Gangadharam P. Mycobacterial dormancy. Tub Lung Dis 1995; 76: 477-479.
Wayne L. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. European J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 908-914.
Wayne L., Hayes L. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through 2 stages of nonreplicating persistence. Infect Immun 1996; 64: 2062-2069.
Beumer R., Devries J., Rombouts F. Campylobacter jejuni nonculturable coccoid cells. Intern J Food Microbiol 1992; 15: 153-163.
Kusters J., Gerrits M., Van Strijp J. el at. Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. Infect Immun 1997; 65: 3672-3679.
Cellini L., Hui P., Leung K. el at. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice. Microbiol Immun 1994; 38: 843-850.
Hirsch С., Yoneda T., Averill L. et al. Enhancement of intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in human monocytes by transforming growth-factor-b-l. J. Infect Dis 1994; 170: 1229-1237.
Bermudez. L., Pelrofsky M. Regulation of the expression of Mycobacterium avium complex proteins differs according to the environment within host cells. Immunol Cell Biol 1997; 75: 35-40.
Woods D., Jones A., Hill P. Interaction of insulin with Pseudomonas pseudomallei . Infect Immun 1993; 61: 4045-4050.
FortierA., Leiby D., Narayanan R. et al. Growth of Francisella tularensis LVS in macrophages - the acidic intracellular compartment provides essential iron required for growth. Ibid 1995; 65:1478-1483.
Duncan S., Glover L., Killham K., Prosser J. Luminescence-based detection of activity of starved and viable but nonculturable bacteria. Appl Environ Microbiol 1994; 60: 1308-1316.
Young D., Duncan K. Prospects for new interventions in the treatment and prevention of mycobacterial disease. Ann. Rev. Microbiol. 1995; 49: 641-673.
Mukamolova G., Kapreilyants A., Young D. et al. A bacterial cytokine. Proc Nat! Acad Sci USA. 1998; 95: 8916-8921.
Шлеева M.О., Мукамолова Г.В., Телков M.В. и др. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление. Микробиология 2003; 72: 76-83.