Биочип или микроматрица – устройство для ранней диагностики раковых клеток, слежения за лечением рака и контроля излечения. Биочипы — высокие технологии в медицинской диагностике Атака на туберкулез

Корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина рассказывает о новейшей российской медицинской разработке. Речь идет о специальном биочипе, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен одобрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания.

Российские ученые разработали специальный биочип, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен ободрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания. Новый метод оценила корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина.
Два года исследований, проб и ошибок. Результат — в лаборатории онкоцентра имени Блохина. Вот так выглядит биочип, и вот так выглядит транспортно-питательная среда. К ним подводят специальный сканер. Все вместе единый комплекс, который может помочь победить рак. Для Марины Савостиковой, одного из авторов разработки, это борьба не только профессиональная, но и личная. Сама дважды пережила страшное заболевание. Она знает: исход зависит от вовремя поставленного диагноза.

«Можем сказать: боже мой, у вас аденомокарценома. И у вас аденомокарценома легкого. Или, допустим, коллега, вам надо исключать колоректальный рак», — пояснила к.м.н., заведующая лабораторией ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Марина Савостикова.

Над тем, чтобы с такой легкостью определять диагноз, трудились ученые в Москве в онкоцентре имени Блохина и Институте микробиологии и эпидемиологии и в Нижнем Новгороде в Медицинской академии. В итоге создали биочип — пластину с 15 ячейками. В каждой находятся разные антитела. Они реагирует на определенный вид рака в клетках. Плюс специальные красители, которые показывают реакцию.

«В данный момент у нас плевральная жидкость от женщины 1929 года рождения и от другой женщины с карценомой яичников. Мы будем проводить их исследование на биочипах», — указывает врач.
Для постановки диагноза требуется не кровь, а выпотная жидкость, которая скапливается в больном организме. Из нее берут образцы, перемешивают, помещают в центрифугу и отбирают осадок.

«Вартексируем, перемешиваем, чтобы клеточная взвесь, которую мы наносим на биочип, имела равномерное распределение во всех ячейках», — отметила научный сотрудник ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Елена Фурминская.
После нагреть его до 37 градусов и на суд врача под флюоресцентный микроскоп. На экране красные и зеленые пятна. Для специалиста рак выглядит именно так.

Не так страшен рак, как его малюют

«Это комплекс рака серозного яичников. Вот единичные клетки, нам их надо было подтвердить, и мы их подтвердили», — указала Марина Савостикова.
Пока это не официальный диагноз, а только результат исследований. Разработчики ждут одобрения Росздравнадзора и планируют начать клинические испытания уже в апреле. После этого биочипы могут появиться в любой российской поликлинике.

Ежегодно в России от рака умирает более 300 тысяч человек. Получается, что каждый день в стране погибает почти тысяча больных. Если у пациента выявили первую стадию, с вероятностью в 93% он выживет, пишет Российский онкологический портал.

Технология белковых биочипов, заменяющих целые иммунроргические лаборатории, дает возможность в тысячи раз увеличить производительность большинства диагностических методов – за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов – и резко снизить себестоимость анализов.

Прообразом современных «живых чипов» послужил саузернблот, изготовленный в 1975 г. Э. Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфичес­кой последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксирован­ных на твердой подложке. В России ученые начали активно раз­рабатывать тему биочипов только в конце 1980-х гг. в институте молекулярной биологии под руководством А. Д. Мирзабекова.

Биочип представляет собой матрицу - пластинку со сторо­ной 5-10 мм, на которую можно нанести до нескольких тысяч различных микротестов; ее еще называют платформой. Чаще всего используют стеклянные или пластиковые платформы, на которые наносятся биологические макромолекулы (ДНК, бел­ки, ферменты), способные избирательно связывать вещества в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используют­ся, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), т. е. матрицы, несу­щие молекулы ДНК. Оставшиеся 6% - белковые чипы.

Биологические микрочипы во многом схожи с электронными: и те, и другие собирают и обрабатывают огромное количе­ство информации на малой поверхности. И те, и другие состоят из огромного количества идентичных миниатюрных элементов, размещенных рядом друг с другом, хотя ячейки биочипа по по­лупроводниковым меркам просто огромны. При этом действие электронного чипа основано на ответе «да-нет», а биологичес­кий чип позволяет выбрать из миллионов или миллиардов воз­можностей единственно верную. Компьютерный чип произво­дит миллионы математических операций в секунду, но и на био­чипе за пару секунд проходят тысячи биохимических реакций.

Разработанный в России биочип-это стеклянная пластинка, на которую нанесены десятки едва видимых глазом полу­сферических гидрогелевых ячеек диаметром менее 100 микрон каждая, и содержащих известные вещества-маркеры. При вза­имодействии биочипа с исследуемым образцом, предваритель­но обработанным светящимся (флуоресцентным) красителем, в соответствующих ячейках происходит химическая реакция, и тогда эти ячейки начинают светиться-тем сильнее, чем ин­тенсивнее процесс.

Принцип действия биологических чипов основан на способ­ности комплементарных оснований образовывать химические связи: в ходе реакции происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК, одна из них (ДНК-проба) с известной пос­ледовательностью нуклеотидов зафиксирована на подложке (пластине), а другая одноцепочечная ДНК-мишень (зонд), меченная флуоресцентной меткой, вносится в ДНК-чип.

По сути, именно в выявления и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора-анализатора биочипов. Так определяются различные характеристики образца, например, присутствие в организме тех или иных возбудителей инфекций или наличие в геноме каких-либо из­мененных генов.

Особенность российских биочипов в том, что их ячейки за­полнены гелем трехмерной структуры. Такие гели удержива­ют большее количество пробы, нежели двумерные, и потому чувствительность отечественных биочипов выше, а, следова­тельно, ниже требования к регистрирующей аппаратуре. Не­маловажно и то, что реакции в объемном геле протекают так же, как и в жидкостях, а значит, как и в живом организме. Это позволяет получить результат, максимально приближенный к реальности.

На Западе исследователи пошли по другому пути и разрабо­тали для создания ДНК-чипов процесс фотолитографии, ана­логичный процессу производства кремниевых процессоров. Например, «Affimetrix» (США) создал GeneChip-технологию, основанную на высокоплотных чипах, содержащих ДНК-последовательности, и предназначенную для анализа генетической информации человека. Такие чипы обладают гораздо большей емкостью, стоят значительно дороже, что пока позволяет ис­пользовать их исключительно в крупных исследовательских центрах или в коммерческих клиниках.

Еще одним методом конструирования биочипов является использование «технологии струйного принтера» для нанесе­ния необходимого нуклеотида в строго определенное место мат­рицы. Он менее дорог, во при этом не позволяет достичь высо­кой скорости синтеза.

Сейчас число размещаемых на российском биочипе ячеек достигает уже нескольких тысяч, однако чаще используются биочипы с гораздо меньшим числом ячеек. Тем не менее про­стой чип может выявить все известные на сегодняшний день формы возбудителя туберкулеза, а также определить, каким именно антибиотиком нужно лечить конкретную форму не за несколько недель, как традиционным способом, а всего в тече­ние нескольких суток.

При помощи белковых чипов с молекулами, «чувствитель­ными» к различным низкомолекулярным соединениям, уже в самое ближайшее время можно будет определить наличие ши­рокого спектра лекарственных веществ, гормонов, наркотиков, ядов, пестицидов практически в любом анализируемом мате­риале.

Контрольные вопросы и задания

1. Что такое реакции иммунитета?

2. В чем заключается сущность реакции агглютинации?

3. Какие варианты реакции преципитации существуют?

4. Охарактеризуйте реакцию связывания комплемента.

5. Что такое метод флюоресцирующих антител?

6. В чем сущность иммуноферментного метода?

7. Опишите особенности радиоиммунологического анализа.

8. Что такое реакции иммунитета?

9. В чем заключается сущность реакции агглютинации?

10. Дайте определение радиоиммунологического анализа?

Биологический микрочип, биочип (biochip, греч. bio(s) - жизнь и logos - понятие, учение; греч. mikros - маленький и англ. chip - осколок) - пластинка-носитель, на которой в определенном порядке расположены многочисленные ячейки (до несколько десятков тыс.) с различными иммобилизованными в них одноцепочечными олигонуклеотидами или олигопептидами, каждый из которых способен избирательно связывать определенное вещество, содержащееся в сложной смеси в анализируемом растворе. Биочип используется для молекулярно-генетических исследований, диагностики различных заболеваний человека, экспресс-диагностики высокопатогенных вирусов, а также в ветеринарии, сельском хозяйстве, криминалистике, токсикологии, охране окружающей среды. Первая работа по биочипам в современном формате (с фрагментами ДНК) была опубликована А. Д. Мирзабековым с сотр. в 1989 г.

Биологические микрочипы (biochips), или, как их чаще называют, DNA microarrays, - это один из новейших инструментов биологии и медицины XXI в. В настоящее время они активно производятся несколькими биотехнологическими фирмами. Биочипную технику можно с успехом применять как для исследовательских целей, так и для диагностики в медицинских учреждениях.

С помощью микрочипов можно проводить одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов, сравнивать их экспрессию. Такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти новые лекарства действуют. Биочипы являются также незаменимым инструментом для биологических исследований, за один эксперимент можно увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

Биочипы позволяют очень быстро определять наличие вирусных и бактериальных возбудителей. Важное медицинское применение биочипов - это диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний. Биочипы позволяют быстро, за считанные дни или даже часы различать внешне неразличимые виды лейкозов. Биочипы применяются для диагностики различных видов раковых опухолей .

Прообразом современных "живых чипов" послужил саузерн-блоттинг , изготовленный в 1975г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке. В России ученые начали активно разрабатывать биочипы в конце 1980-х годов в Институте молекулярной биологии РАН под руководством А.Д.Мирзабекова.

Точнее всего биочипы описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе. Профессионалы называют этот носитель платформой. Платформа - это чаще всего пластинка из стекла (иногда используют и другие материалы, например кремний), на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используются, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), т.е. матрицы, несущие молекулы ДНК. Оставшиеся 6% составляют белковые чипы.

Организованное размещение макромолекул занимает на платформе очень небольшой участок размером от почтовой марки до визитной карточки. Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью флюоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения ( рис. 2.50).

Характерные размеры ячеек современных микрочипов лежат в пределах 50-200 мкм, общее число ячеек на чипе составляет 1000-100000, а линейные размеры чипа - порядка 1 см. В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Также чипы могут наращиваться прямо из стеклянной пластинки методом фотолитографии с использованием специальных микромасок. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры (пины) механического робота, или с помощью технологии струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. На биочипе в дальнейшем гибридизуют молекулы ДНК, меченные красителем.

Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флюоресцентной или радиоактивной метки. В случае смеси молекул ДНК (например, ДНК дикого типа и ДНК с мутациями) каждая метится своим флюоресцентным красителем. Свойства красителя не должны сильно зависеть от состава (A/Т или G/C) ДНК и температуры. Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера или люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. Однако флюоресценция является основным, но не единственным методом изучения гибридизации. В частности, данные о характере гибридизации можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК по правилу Уотсона-Крика: A-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК точно удовлетворяет условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при конечных температурах их будет больше, чем несовершенных дуплексов с нарушением условий комплементарности, и, соответственно, совершенным дуплексам будет отвечать более сильный сигнал флюоресценции. В выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора - анализатора биочипов.

Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. В более продвинутых технологиях ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Кроме того, непосредственно на чипе можно осуществлять фрагментацию, фосфорилирование, лигирование ДНК или мини-секвенирование, при котором длина дуплекса увеличивается на одну пару оснований. Последнюю технику можно эффективно использовать для поиска мутаций.

На Западе и в России сейчас сформировалось два разных направления и два разных стандарта по созданию и применению биочипов. Российские биочипы дешевле, а западные - объемнее. При этом в России биочипами занимаются пока преимущественно исследовательские лаборатории, а на Западе - это, в первую очередь, военные исследования и коммерческое производство чипов для диагностики.

Российские ученые из МФТИ и еще нескольких академических институтов создали чип, который позволяет с высокой точностью определять один из самых распространенных раков - колоректальный (так называют злокачественные опухоли толстой и прямой кишки).

ЧТО АМЕРИКАНЦАМ ЗАПРОСТО...

Крайне важно, что новый тест очень прост, кровь для него берут из вены точно так же, как для обычного так называемого биохимического анализа. Поэтому он будет хорошо подходить для скрининга - быстрого и простого отбора пациентов даже с ранними формами рака. Сейчас в мире для этого рекомендуют колоноскопию, которую после 50 лет нужно проводить не реже одного раза в десятилетие. Это совсем непростая и не очень приятная процедура, при которой гибкий эндоскоп вводят через прямую кишку в толстый кишечник. В США это профилактическое исследование для людей старше пятидесяти поставлено на поток. Каждый эпизодически получает по почте приглашение на такую диагностическую процедуру.

У нас такое исследование проводят по показаниям, когда есть симптомы какого-либо заболевания толстого кишечника. Если же кто-то хочет просто провести такое профилактическое исследование, как это делают в США, чтобы не проморгать болезнь, это можно сделать на платной основе в индивидуальном порядке. Может быть, всем поголовно его и не стоит делать, но тем, у кого есть факторы риска развития колоректального рака, это исследование лишним не будет.

Почему ранняя диагностика рака толстой и прямой кишки так важна? Во-первых, это заболевание одно из самых распространенных - в развитых странах эта злокачественная опухоль стоит на 3-м месте среди всех видов рака. Во-вторых, болезнь весьма тяжелая и тяжело лечится. Несмотря на большие достижения в ее лечении, результаты далеко не самые лучшие: пятилетнее выживание после хорошей терапии бывает примерно у 60-65% пациентов. И в-третьих, если опухоль выловить на ранних стадиях, то результаты будут гораздо лучшими. Для этого и нужен скрининг. И лучше простой и не очень затруднительный, как колоноскопия.

НАУКА - ПРАКТИКЕ

Над поиском такой методики трудится немало ученых в мире. Например, в США недавно появился метод диагностики по сложному анализу стула. Но наши ученые предложили еще более удачное решение. Про-цедура исследования сведена к забору крови из вены, как это делают при биохимическом анализе крови. Российский биочип построен на совсем иных принципах, чем американский набор для диагностики. Хорошо известно, что в крови есть маркеры, которые могут свидетельствовать о наличии опухоли. Они тем или иным образом связаны с обменом веществ в злокачественных клетках и с ответом организма на опухоль. И таких маркеров много. Беда в том, что они весьма капризны: могут быть не только при колоректальном раке, но и при других опухолях и даже при иных состояниях. То есть их специфичность для данного вида рака не всегда достаточна для уверенной постановки диагноза. Наши ученые нашли выход из этой проблемы: они сделали комбинированный чип, который определяет сразу не один маркер, а много. Благодаря этому точность диагностики повысилась многократно.

Не будем приводить названия маркеров, которые определяются при использовании чипа. Для нас гораздо важнее чувствительность предложенного теста - она составляет 88%. То есть он определяет наличие опухоли у 88% больных из 100. Это очень хороший показатель.

Отчет об исследовании отечественного чипа опубликован на днях во влиятельном международном журнале Cancer Medicine, и есть все основания полагать, что скоро такая полезная диагностическая система поступит в практическое здравоохранение. И самое главное, по этому же принципу можно разработать диагностические чипы и для других видов рака.

Материал подготовил Олег Днепров

Фото THESTAR.COM

ФАКТОРЫ РИСКА КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА:

• наличие таких болезней, как дивертикулы толстой кишки и неспецифический язвенный колит (болезнь Крона);
• возраст старше 50 лет;
• наличие этой опухоли у кровных родственников;
• большое содержание жиров и мяса в питании;
• пристрастие к алкоголю;
• курение;
• сахарный диабет, ожирение, низкая физическая активность.

Биочип для ранней диагностики рака

Ученые Национальной лаборатории Аргонн Исследовательского центра ядерной энергетики (г. Чикаго, штат Иллинойс) разработали биочип, позволяющий диагностировать определенные типы рака до появления его симптомов.

Компания Eprogen лицензировала эту технологию и использует для поиска новых биомаркеров рака. Опухоли, даже на самых ранних, бессимптомных стадиях, вырабатывают белки, попадающие в кровоток и запускающие иммунные реакции, в частности, синтез антител. Специалисты компании утверждают, что сравнение профилей аутоантител здоровых людей и онкологических пациентов является перспективным методом поиска ранних индикаторов заболеваний.

Используемый ими процесс, получивший название двумерное фракционирование белков, позволяет сортировать тысячи различных белков злокачественных клеток по различиям их электрического заряда и гидрофобности. С помощью этого метода исследователи получают 960 белковых фракций, которые помещают в биочип, содержащий 96-луночные пластинки. После этого биочип обрабатывают заранее известными аутоантителами, синтезируемыми иммунной системой онкологических пациентов.

Использование аутоантител больного для диагностики позволит врачам подбирать лечение согласно его индивидуальному профилю аутоантител. Уникальность нового метода заключается в том, что ученые используют реальные данные о заболевании человека для получения новой, более подробной диагностической информации, которую специалисты могут использовать для изучения и лечения рака.

По словам разработавшего технологию специалиста Национальной лаборатории Аргонн Дэниеля Шабакера (Daniel Schabacker), биочипы уже продемонстрировали большой потенциал в диагностической медицине. Кроме Eprogen, технологию лицензировали еще три компании. Одна из них, Akonni Biosystems, уже разработала на ее основе несколько десятков тестов, выпускаемых под торговой маркой TruArray. Еще одна компания, Safeguard Biosystems, лицензировала биочипы для создания ветеринарных диагностических наборов.

Например, при диагностике заболеваний верхних дыхательных путей содержащиеся в мазке из полости рта пациента антитела или ДНК связываются с нанесенными на биочип молекулами. После обработки лунки биочипа, в которых произошло такое связывание, начинают светиться. Специальная программа расшифровывает сканированное с помощью компьютера изображение, рассчитывает статистическую вероятность присутствия того или иного инфекционного агента и предоставляет информацию врачу.

Разработка диагностических средств, подобных TruArray, способна совершить революцию в диагностике, т.к. она позволяет одновременно проводить диагностику большого количества заболеваний. Одним из уникальных свойств метода является возможность одновременного тестирования на инфекции бактериальной и вирусной природы.

Проведение анализа с помощью биочипа занимает около 30 минут и обеспечивает конфиденциальность и высокую точность диагностики, т.к. врач, не выходя из кабинета, может практически на глазах пациента определить характер заболевания и стадию его развития.

У пациентов с сахарным диабетом мелкие плотные частицы Х-ЛПНП содержат гликозилированный Апо В

Charlton-Menys (University of Manchester, Великобритания) оценили степень гликозилирования различных субфракций липидов у 44 добровольцев с СД. Оказалось, что средний уровень гликозилированного Апо В составил 3,0 мг/дл, причем 84,6% гликозилированного Апо В были в составе Х-ЛПНП, а 67,8% - в составе наиболее атерогенной субфракции, а именно мелких плотных частиц Х-ЛПНП.

Уровень мелких плотных частиц Х-ЛПНП в наибольшей степени коррелирует с толщиной интима-медиа сонных артерий

Tetsuo Shoji (Osaka City University Graduate School of Medicine, Япония) с соавторами определи уровни липидов у 326 пациентов, обследованных по поводу индекса массы тела сонных артерий. Исследователи показали выраженную корреляцию уровня мелкого плотного Х-ЛПНП с толщиной интимы-медиа сонных артерий (коэффициент корреляции 0,441). Корреляция других липидов с толщиной интимы-медии оказалась следующей: аполипопротеин В (0,279), Х-ЛПНП 0,249), и триглицериды (0,175). У пациентов с высоким уровнем С-реактивного белка уровни мелких плотных Х-ЛПНП оказались ниже, чем у пациентов с низкими уровнями С-реактивного белка.

Atherosclerosis 2008; Advance online publication.