Среди штаммов escherichia coli есть патогенные. Кишечная палочка (эшерихиоз)

Кишечная палочка является довольно распространенным микроорганизмом, вызывающим многочисленные проблемы пищеварительного тракта, мочевыделительной и половой систем у человека, обладающая способностью присутствовать на кожных покровах и слизистых оболочках различных систем организма как вариант нормы.

Кишечная палочка (Escherichia coli или E. coli) – грамотрицательная бактерия (в мазках, окрашенных по Грамму, не окрашивается), относящаяся к Семейству Энтеробактерии, имеющая форму палочки, являющаяся факультативным анаэробом (то есть в основном развивается без наличия кислорода, но в определенных условиях при поступлении кислорода также не теряет своей жизнеспособности). Открыта кишечная палочка была в 1885 году немецким бактериологом Теодором Эшерихом. Палочки имеют закругленные концы, размер от 0,4 до 3 мкм. Некоторые штаммы обладают подвижностью за счет наличия жгутиков, остальные – неподвижны.

Оптимальная температура роста кишечной палочки – 37°. E.coli достаточно устойчива во внешней среде, в таких средах как вода, почва, а также испражнениях сохраняет жизнеспособность длительное время. Имеют способность размножаться в пищевых продуктах (например, молоко). При кипячении погибает практически сразу, при температуре 60º в течение 15 минут, дезинфицирующие вещества (растворы хлорамина, формалина и прочее) губительно действуют на кишечную палочку в течение короткого времени.

Различают многочисленные штаммы (разновидности) кишечной палочки, из которых большинство представителей являются безвредными и в нормальных условиях располагаются на слизистых оболочках пищеварительного тракта, причем преимущественно в нижних его отделах.

Кишечная палочка в норме

В нормальных условиях кишечная палочка заселяет кишечник человека (безопасные ее штаммы), среднее количество варьирует от 10 6 до 10 8 КОЕ/г содержимого дистального отдела кишечника (КОЕ – колониеобразующая единица). Содержание E.coli в составе другой микрофлоры кишечника не более 1%. В обычных условиях кишечная палочка принимают участие в нормальном функционировании кишечника, синтезирует витамины К, В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12. Очень важная функция – конкурентное взаимодействие с условно-патогенной флорой кишечника (ограничение размножения условно-патогенных микроорганизмов).

Непатогенный штамм Nissle 1917 (Mutaflor) применяется с лечебной целью у детей в качестве пробиотика при дисбактериозе кишечника. В кишечнике более полезны так называемые лактозопозитивные кишечные палочки, содержание лактозонегативных не должно превышать 10 5 КОЕ/г, а гемолитические E. coli и вовсе должны отсутствовать.

Качественный и количественный состав E.coli толстого кишечника у здоровых людей разных возрастов, как у детей до года, так и старше 60 лет, не имеет различий. Для типичных E.coli это 10 7 -10 8 КОЕ/г фекалий, E.coli лактозонегативные < 10 5 , гемолитические кишечные палочки в норме отсутствуют. Состав остальной флоры кишечника отличается по возрастам по другим параметрам.

Отклонения в содержании непатогенных штаммов кишечной палочки в кишечнике называются дисбактериозом и имеют несколько степеней.

Степени микробиологических нарушений E. coli при дисбактериозе кишечника

1-я степень микробиологических нарушений : типичных эшерихий до 10 6 -10 5 КОЕ/г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 10 9 - 10 10 КОЕ/г
2-я степень микробиологических нарушений : повышение содержания гемолитических эшерихий до концентрации 10 5 -10 7 КОЕ/ г
3-я степень микробиологических нарушений : обнаружение E.coli в ассоциации с другими условнопатоген-ными микроорганизмами в концентрации 10 6 -10 7 КОЕ/г и выше

Патогенные кишечные палочки

Выделяют более 100 штаммов патогенной кишечной палочки, которые объединены в 4 класса:
- энтеропатогенные E. Coli (ETEC);
- энтеротоксигенные E. coli;
- энтероинвазивные E.coli (EIEC);
- энтерогеморрагические E.coli (EHEC).

Морфологически они ничем не отличаются. Особенностью патогенных штаммов является способность при попадании в организм человека продуцировать энтеротоксины (термостабильные или стойкие к высоким температурам и термолабильные или быстроразрушающиеся), за счет которых возникает диарея. Например, E.coli O157:H7, которая продуцирует подобные токсины. Помимо этого для каждой группы характерны свои особенности симптомов заболевания.

Поражение кишечной палочкой желудочно-кишечного тракта

Эшерихиозы – заболевания, возникающие в результате попадания в организм патогенных штаммов кишечных палочек, характеризующиеся интоксикацией и поражением преимущественно желудочно-кишечного тракта, но иногда поражающих мочевыводящую систему, желчевыводящие пути и другие органы с возможностью у некоторых пациентов возникновения сепсиса.

Механизм заражения алиментарный, путь фекально-оральный. Факторами передачи являются загрязненная вода и пищевые продукты. В большинстве своем заболевают дети раннего возраста.

Инкубационный период (с момента заражения до возникновения клинической картины) от 48 до 72 часов чаще всего (реже сокращается до 1 дня или продлевается до 10 суток).

Эшерихиозы, вызванные энтеропатогенной кишечной палочкой : чаще поражаются новорожденные и дети первого года жизни. Являются причиной диареи в роддомах. У маленьких пациентов рвота или срыгивание, частый жидкий стул без патологических примесей (кровь), выраженные боли в животе, беспокойство ребенка, отказ от еды, нарушенный сон.

Эшерихиозы, вызванные энтеротоксигенной кишечной палочкой : данные штаммы обладают способностью прикрепляться к клеткам эпителия кишечника, существенно нарушая их функцию и вызывая сильную водянистую диарею. Также часто проявляются у детей, взрослых и при так называемой «диарее путешественников». У пациентов водянистый стул, без крови, позывы на рвоту, болезненность в животе.

Эшерихиозы, вызванные энтерогеморрагической кишечной палочкой : вызывает геморрагический колит, в тяжелых случаях проявления гемолитико-уремического синдрома (ГУС). При геморрагическом колите у пациентов высокая температура до 39-39,5º, симптомы интоксикации, схваткообразные (или спастические) боли в животе, а также появление водянистого стула с примесью крови. Осложнениями могут быть развитие анемии гемолитического характера, острой почечной недостаточности и геморрагического синдрома.
Гемолитико-уремический синдром (ГУС) – специфический синдром, для которого характерна триада симптомов – гемолитическая анемия, острая почечная недостаточность и критическое падение количества тромбоцитов. Возникает чаще в детской возрастной группе от 6 мес до 4х лет, а также у пожилых пациентов. В 90% случаев встречается при кишечных инфекциях (E.coli, продуцирующая веротоксин, Shigellae и прочие). Причина – поражение клеток эндотелия сосудов. Возникает в среднем через неделю после перенесенной инфекции. Клинически может появиться лимонного цвета желтуха, нарушение оттока мочи, отеки, кровоизлияния на коже и другие тяжелые проявления. Однако при появлений данной симптоматики можно говорить о развернутой клинической картине ГУС. Ранними же его признаками являются лабораторные: появление белка в моче - протеинурия, появление эритроцитов в моче – эритроцитурия, повышение креатинина сыворотки крови, а также снижение эритроцитов и гемоглобина в крови.

Эшерихиозы, вызванные энтероинвазивной кишечной палочкой : по биохимическим свойствам энтероинвазивные E.coli сходны с шигеллами – возбудителями дизентерии, в частности обладают способностью проникать в клетки эпителия определенного отдела кишечника (ободочной кишки) и там размножаться. Этим объясняется и появление определенной симптоматики при таких эшерихиозах: боли в подвздошной области слева (слева внизу живота), обильный водянистый стул с примесью крови. В отличие от дизентерии, чаще это все-таки водянистый стул, а не скудный со слизью и кровью (как при шигеллезе).
Обобщая вышесказанное, понятно, что нет единой специфической картины эшерихиозов, жалобы пациентов могут быть различными: температура, рвота, водянистый стул без примесей и с кровью, боли в животе разной локализации ноющего характера.

Поражение кишечной палочкой мочевыводящих путей

Механизм заражения чаще связан с непосредственным поступлением кишечной палочки из толстого кишечника при несоблюдении или недостаточном соблюдении личной гигиены, а также при использовании нетрадиционных способов сексуальных контактов (с применением анального секса).

До 80-85% инфекций мочевыводящих путей связано с E. coli. Более 60% острых процессов при воспалении предстательной железы связано именно с этим возбудителем. Подавляющее большинство хронических простатитов связано с кишечной палочкой.

Клинические формы поражения мочевыводящей системы различны. Это могут быть уретриты , циститы , пиелонефриты , простатиты .

Поражение кишечной палочкой половой системы

Большая часть воспалительных процессов в придатке яичка (эпидидимит), воспаление яичка (орхит), а также их сочетанное поражение , воспаление яичников (аднекситы) связано именно с кишечной палочкой.

Диагностика инфекций, вызванных кишечной палочкой

1) Бактериологический метод – посев биологического материала на специальные питательные среды. Материалом служат при инфекциях кишечника – испражнения и рвотные массы, при инфекциях мочевыделительной системы – моча, при инфекциях половой системы – мазки и соскобы со слизистых половых органов. После идентификации возбудителя проведение антибиотикограммы (определение чувствительности к антибиотикам).
При отклонении содержания кишечной палочки в испражнениях ставят определенную степень микробиологических нарушений (дисбактериоза) или обнаруживают патогенные штаммы кишечной палочки. Наличие E.coli в моче называется бактериурией. При отсутствии симптомов диагноз выставляется при появлении микроорганизмов в количестве 10 5 и выше КОЕ/мл мочи. Если их количество меньше, то считают это признаком контаминации (загрязнение мочи при заборе). Если же симптомы болезни явно выражены, то достаточно 10 2 -10 4 КОЕ/мл мочи.

2) Общеклинические методы исследования (копрограмма, общий анализ мочи, крови, биохимическое исследование крови и другие) являются дополнительными.
3) Инструментальные методы исследования (ректороманоскопия, урография, УЗИ и другие).

Общие принципы лечения инфекций, вызванных кишечной палочкой

1. Организационно-режимные мероприятия (госпитализация по клиническим показаниям), диетный режим согласно поражению определенных систем организма (стол № 4 при поражении кишечника, стол № 7 при поражении мочеполовой системы).

2. Медикаментозная терапия включает этиотропную терапию (антибиотики, бактериофаги), патогенетическую терапию (чаще инфузионную), посиндромальную терапию.

Антибактериальная терапия должна проводиться с учетом антибиотикограммы выделенной кишечной палочки. Чаще выявляется чувствительность кишечной палочки к препаратам группы фторхинолона (ципрофлоксацин, левофлоксацин), амоксициллину, нитрофуранам, и другим. И сам препарат, и его дозу, и продолжительность курса лечения назначается только врачом. Самолечение в целях профилактики развития устойчивости кишечной палочки к антибиотикам недопустимо!

Также в отношении E.coli достаточно эффективны бактериофаги (применяются при поражении кишечника) – это бакериофаг коли жидкий, интестибактериофаг, колипротейный бактериофаг, пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиобактериофаг поливалентный комбинированный жидкий и другие.

Специально полученные штаммы кишечной палочки входят в состав некоторых лекарственных препаратов, которые используются при дисбактериозе с недостатком E. coli в кишечнике (хелак форте, бификол, колибактерин). Также при дисбактериозе с избыточным ростом кишечной палочки назначаются пробиотики (линнекс, аципол, ацилакт, лактобактерин, бифиформ, бифистим и другие).

Патогенетическая терапия сводится к проведению инфузионной терапии - введения в кровоток различных растворов определённого объёма и концентрации с целью дезинтоксикации и восполнения потерь жидкости при поражении желудочно-кишечного тракта, а также детоксикации организма при поражении почек.

Посиндромальная терапия назначается врачом индивидуально в зависимости от ведущего синдрома заболевания.

Особенности лечения детей и беременных: в данных группах пациентов схемы лечения начинаются с использованием биактериофагов и пробиотиков и только при неэффективности данных препаратов назначаются антибактериальные препараты с учетом возраста, степени поражения.

Профилактика инфекций, вызванных кишечной палочкой

На первом месте при профилактике стоит соблюдение личной гигиены и правил тепловой обработки и хранения пищевых продуктов, мытье овощей и фруктов, а также недопущение употребления в пищу воды из неизвестных источников.

Врач инфекционист Быкова Н.И.

Вконтакте

Одноклассники

(лат. Escherichia coli, E. coli, по имени Теодора Эшериха) - грамотрицательная палочковидная бактерия, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов. Большинство штаммов кишечной палочки являются безвредными, однако серотип O157:H7 может вызывать тяжёлые пищевые отравления у людей. Безвредные штаммы являются частью нормальной флоры кишечника человека и животных. Кишечная палочка приносит пользу организму хозяина, например, синтезируя витамин K , а также предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике.

Кишечная палочка была описана немецким педиатром и бактериологом Теодором Эшерихом в 1885 году.

Штаммы

Штамм - это совокупность особей внутри вида, которая обладает свойствами, отличными от свойств других особей. Часто такие отличия могут быть обнаружены только на молекулярном уровне, однако, имеют эффект на физиологию бактерии или жизненный цикл. Разные штаммы кишечной палочки часто специфичны к определённым хозяевам, что делает возможным определение источника фекального заражения в образцах. Например, если известно, какие штаммы кишечной палочки представлены в образце воды, можно определить источник заражения, например, человек, другое млекопитающее или птица.

Новые штаммы кишечной палочки появляются в результате мутаций и горизонтального переноса генов. Некоторые штаммы вырабатывают особенности, губительные для организмов хозяина, такие ядовитые штаммы могут вызывать диарею, что неприятно в случае взрослых и может привести к летальному исходу у детей в развивающихся странах. Более ядовитые штаммы, например, O157:H7 вызывают тяжёлые заболевания и даже приводят к смерти у пожилых людей, маленьких детей и лиц с ослабленным иммунитетом.

Роль в нормальной микрофлоре

Некоторые штаммы кишечной палочки, например, O157:H7, O121 и O104:H21, синтезируют потенциально смертельные токсины. Пищевые отравления, инфекционным агентом при которых являются ядовитые E. coli, обычно вызваны употреблением в пищу немытых овощей или непрожаренного мяса.

Желудочно-кишечные инфекции

Ядовитые штаммы кишечной палочки в норме отсутствуют в кишечнике, и заболевание наступает при заражении извне. Передача патогенных E. coli часто происходит фекально-оральным путём.

Частые пути передачи могут быть вызваны:

• низкой гигиеной приготовления пищи,
• загрязнением продуктов навозом,
• поливом урожая загрязнённой водой или сточными водами,
• при выпасе диких свиней на пашнях,
• употреблением для питья воды,
• загрязнённой сточными водами.

Помимо этого, нарушить нормальную микрофлору кишечника может прием некоторых антибиотиков, подавляющих те микроорганизмы, которые отвечают за предотвращение размножения патогенной флоры.

Заражение патогенными штаммами кишечной палочки происходит преимущественно фекально-оральным путем. Способствует развитию заболеваний нарушение правил гигиены приготовления пищи, употребление грязных фруктов и овощей, использование для полива загрязненной или сточной воды и проч. Опасно также есть плохо прожаренное мясо или пить некипяченое молоко , ведь коровы, козы, свиньи и овцы могут быть носителями патогенных штаммов E. coli.

Симптомами кишечной палочки становится развернутая клиническая картина кишечного дисбактериоза: помимо расстройств стула (запоры , поносы), у больного наблюдаются тошнота и рвота, вздутие и боль в животе. Меняется запах каловых масс, появляется неприятный запах изо рта. Среди симптомов общей интоксикации – повышенная утомляемость, слабость, сонливость, отсутствие аппетита.

В случае заболеваний кишечника у новорождённых, при болезни Крона и при неспецифическом язвенном колите обнаруживают повышенные уровни кишечной палочки в слизистых ЖКТ.

Лечение кишечной палочки

Лечение кишечной палочки заключается в приеме специально подобранных антибиотиков. Чаще всего это препараты из группы аминогликозидов. Чтобы лечение было более эффективным, больному рекомендуется сделать посев содержимого кишечника. Если кишечная палочка вызвала диарею, необходимо восстановление водно-электролитного баланса с помощью регидратации. В целом, лечение зависит в первую очередь от штамма кишечной палочки.

Важно! Лечение проводится только под контролем врача. Самодиагностика и самолечение недопустимы!

КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА (ESCHERICHIA COLI)

Кишечная палочка (эшерихия коли, лат. escherichia coli; общепринятое сокращение E. coli) - вид грамотрицательных палочковидных бактерий, входящий в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.

Вид эшерихия коли (e. coli) входит в род эшерихии (лат. escherichia), семейство энтеробактерии (лат. enterobacteriaceae), порядок энтеробактерии (лат. enterobacteriales), класс гамма-протеобактерии (лат. γ proteobacteria), тип протеобактерии (лат. proteobacteria), царство бактерии.

Существует большое число разновидностей кишечной палочки (escherichia coli), в том числе, более 100 патогенных («энтеровирулентных») типов, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и энтерогеморрагические. Морфологические различия между патогенными и непатогенными эшерихиями отсутствуют.

Кишечные палочки. Общие сведения

Кишечные палочки (escherichia coli) устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях. Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.). Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями . Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты - в течение 15 минут.

Часть кишечных палочек имеет жгутики и подвижны. У других кишечных палочек жгутики и способность к движению отсутствуют.

Escherichia coli в кишечнике и кале человека

Число кишечных палочек escherichia coli среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1%, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Кишечные палочки забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий. Кишечные палочки вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12, К, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных и жирных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция.

Escherichia coli в кишечнике человека появляются в первые дни после рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 106-108 КОЕ/г содержимого толстой кишки. В фекалиях здорового человека кишечные палочки (типичные) выявляются в количестве 107-108 КОЕ/г, при этом количество лактозонегативных кишечных палочек не должно превышать 105 КОЕ/г, а гемолитические кишечные палочки должны отсутствовать.

Отклонения от указанных значений является признаком дисбактериоза:

- снижение типичных кишечных палочек до 105-106 КОЕ/г, или повышение содержания типичных эшерихий до 109-1010 КОЕ/г определяется, как первая степень микробиологических нарушений

- повышение концентрации гемолитических кишечных палочек до до 105-107 КОЕ/г определяется, как вторая степень микробиологических нарушений

Эшерихиозы

Патогенные серотипы кишечных палочек могут быть причиной эшерихиозов - различных инфекционных заболеваний, протекающих с интоксикацией, лихорадкой, обычно с поражением желудочно-кишечного тракта, реже - мочевыводящих, желчевыводящих путей, других органов или с развитием сепсиса. Эшерихиозы чаще встречаются у детей раннего возраста. Механизм распространения эшерихиозов ЖКТ - фекально-оральный. Чаще всего заражение происходит через загрязнённую пищу или воду.

Энтеропатогенная кишечная палочка

Энтеропатогенная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - ETEC. Кишечные инфекции, вызываемые энтеропатогенными штаммами кишечных палочек, развиваются чаще всего в тонкой кишке у детей первого года жизни, в том числе у новорождённых. Заболевание сопровождается сильным поносом с водянистым стулом без примеси крови, выраженными болями в животе, рвотой. Энтеропатогенные escherichia coli являются частой причиной диарей в родильных домах. Штаммы ETEC являются основной причиной развития острой водянистой диареи в развивающихся странах, особенно в теплый и влажный сезон. Как в развитых, так и в развивающихся странах штаммы энтеропатогенной кишечной палочки являются наиболее распространенной причиной «диареи путешественников», которая обычно проходит без лечения.

Энтеротоксигенная кишечная палочка

Энтеротоксигенные кишечные палочки обладают способностью прикрепляться к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкой кишки и продуцировать токсины, вызывающих диарею. Энтеротоксигенные кишечные палочки являются основной причиной острых диарей у детей и взрослых и наиболее частой причиной так называемой «диареей путешественников».

Энтерогеморрагическая кишечная палочка

Энтерогеморрагические кишечные палочки (EHEC) являются причиной геморрагического колита, а также тяжелого заболевания - гемолитико-уремического синдрома (микроангиопатической гемолитической анемии, сочетающейся с почечной недостаточностью; аббревиатура ГУС или HUS).

Для геморрагического колита характерно острое начало в виде сильных спастических болей в животе и водной диареи, которая вскоре становится кровавой. Лихорадка обычно отсутствует, но у некоторых температура тела может достигать 39 °С. В легких случаях геморрагического колита продолжается 7–10 дней. Приблизительно в 5 % случаев геморрагический колит осложняется геморрагическим синдромом, острой почечной недостаточностью и гемолитической анемией.

Источником инфекции мая 2011 года в Германии и других европейских странах являлся штамм продуцирующей шига-токсин STEC (синоним: продуцирующей веротоксин - VTEC) энтерогеморрагической кишечной палочки.

Заражение STEC или VTEC-кишечной палочкой происходит чаще всего через продукты питания или при близком контакте с больными людьми или животными. Для начала заболевания достаточно небольшого числа STEC/VTEC Escherichia coli.

Установлено, что возбудителем европейской инфекции мая 2011 года является кишечная палочка серологической группы E. coli O104 (серотип E. coli O104:H4), имеющая в своем геноме ген, ответственный за продукцию шига-подобного токсина 2-го типа.

Штаммы E. coli O104:H4, выделенные от пациентов, характеризовались резистентностью к бета-лактамным антибиотикам за счет продукции бета-лактамазы расширенного спектра, но оставались чувствительными к группе аминогликозидов (гентамицин) и фторхинолонам.

После заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой инкубационный период длится чаще всего от 48 до 72 часов, но может быть и от 1 до 10 дней. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. Могут наблюдаться лихорадка и рвота. Большинство больных выздоравливают в течение 10 дней. Иногда инфекция может приводить к опасным для жизни состояниям, таким как гемолитико-уремический синдром.

Энтероинвазивная кишечная палочка

Энтероинвазивная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - EIEC. Энтероинвазивные кишечные палочки являются причиной заболеваний, похожих по проявлению на бактериальную дизентерию (причиной которой являются шигеллы). Штаммы EIEC подобны штаммам Shigella как биохимически, так и серологически. Как и в случае Shigella, энтероинвазивные кишечные палочки проникают в эпителиальные клетки ободочной кишки и размножаются там. У больного отмечаются боли в животе, обильный водянистый понос с примесью крови.

В развивающихся странах штаммы EIEC встречаются редко. Они служат причиной возникновения периодических вспышек инфекций пищевого происхождения среди детей и взрослых. Симптомы заболевания имеют много общего с проявлениями шигеллёза. Предположительно против EIEC эффективны те же антибиотики, что и против Shigella при условии сохранения чувствительности этого штамма на той или иной территории, однако результативность терапии еще никогда не оценивалась в рамках контролируемых исследований.

Escherichia coli - возбудитель заболеваний мочеполовых органов

Инфицирование кишечными палочками (а также другими уропатогенными микробами, обитающими в кишечнике) мочеполовых органов, особенно у женщин, часто происходит непосредственно из желудочно-кишечного тракта при недостаточном соблюдении гигиены или применении специфических сексуальных практик.

Кишечные палочки являются причиной:

- около 80 % внебольничных инфекций мочевыводящих путей

- 64 % всех заболеваний острым простатитом

- 80 % всех хронических простатитов

- для пациентов старше 35 лет - большей части всех эпидидимитов (воспалительный процесс в придатке яичка), орхитов (воспаление яичка) и эпидидимоорхитов (сочетанное воспаление яичка и придатка яичка)

- 70-95 % инфекций мочевых путей, достигающих мочевого пузыря или почки восходящим путем

- других заболеваний мочеполовых органов.

Бактериурия - наличие бактерий в моче может являться признаком воспаления в мочевыводящих путях, мочевом пузыре, почках. При отсутствии каких-либо симптомов, истинная бактериурия (инфекция мочевых путей) диагностируется при наличии не менее 105 микробных тел кишечных палочек (или других энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи, иначе предполагается, что загрязнение мочи происходит при ее заборе. Если бактериурия не сопровождается какими-либо симптомами, тогда она называется бессимптомной. Бессимптомная бактериурия не всегда требует немедленного лечения.

При наличии симптомов или при заборе мочи катетером диагностический порог может быть значительно уменьшен. В частности, при наличии клинической симптоматики (лихорадка, озноб, тошнота, рвота, боли в поясничной области, дизурия) и выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи, критерием для диагностики острого пиелонефрита является наличие не менее 104 кишечных палочек (или других патогенных энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи. Острый цистит диагностируется при наличии соответствующей клинической симптоматики, выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи и обнаружении не менее 102 кишечных палочек (или других колиформных бактерий) в 1 мл мочи.

Штаммы Escherichia coli - пробиотики и компоненты лекарств

Штамм кишечной палочки Escherichia coli Nissle 1917 (DSM 6601) считается наиболее эффективным пробиотиком, помогающим уменьшить воспаление и оттянуть следующий приступ язвенного колита.

Специально подобранные штаммы эшерихии коли входят в состав лекарств: Хилак форте (штамм DSM 4087), Бификол (штамм М-17), Колибактерин (штамм М-17) и других.

Антибиотики, активные в отношении кишечной палочки

Антибактериальные средства, активные в отношении кишечной палочки: амоксициллин, левофлоксацин, нифурател, нифуроксазид, рифаксимин, фуразолидон, ципрофлоксацин.

Escherichia coli (кишечные палочки ) - грам-отрицательные палочковидные бактерии, принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, род Escherichia (эшерихия), короткие (длина 1-3 мкм, ширина – 0,5-0,8 мкм), полиморфные подвижные и неподвижные, спор не образуют. Впервые были открыты немецким ученым Эшерихом (T. Escherich) в 1885 году. E. coli были выделены из остатков жизнедеятельности человека. E. coli является естественных обитателем толстого отдела кишечника многих млекопитающих, в частности приматов и человека. К бактериям группы кишечных палочек относят роды Escherichia (типичный представитель Е. coli), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств.
В организме человека E.coli подавляет рост патогенных бактерий и синтезирует некоторые витамины. Существуют разновидности E.coli, котрые способны вызывать у человека острые кишечные заболевания. Выделяют более 150 типов патогенных (так называемых "энтеровирулентных") палочек E.coli, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные (ЭПЭК), энтеротоксигенные (ЭТЭК), энтероинвазивные (ЭИЭК) и энтерогемморагические (ЭГЭК)

Рис. 1

Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (B.paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.

Рис. 2

Биохимические свойства

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые формируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

Устойчивость во внешней среде

Е. coli не устойчивы к высокой температуре. Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65 - 75° С). При 60° С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут, сулема в разведении 1:1000 - через 2 мин., устойчивы к действию многих анилиновых красителей. Сохраняемость кишечной палочки при низких температурах и в различных субстратах внешней среды изучена недостаточно. По некоторым данным в воде и почве кишечная палочка может сохраняться несколько месяцев.

Санитарно-показательное значение

Санитарно-показательное значение отдельных родов бактерий группы кишечных палочек неодинаково. Обнаружение бактерий рода Escherichia в пищевых продуктах, воде, почве, на оборудовании свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, что имеет большое санитарное и эпидемиологическое значение. Считают, что бактерии родов Citrobacter и Enterobacter являются показателями более давнего (несколько недель) фекального загрязнения и поэтому они имеют меньшее санитарно-показательное значение по сравнению с бактериями рода Escherichia. При длительном применении антибиотиков в кишечнике человека также обнаруживают различные варианты кишечной палочки. Особый интерес представляют лактозоотрицателъные варианты кишечной палочки. Это измененные эшерихии, утратившие способность сбраживать лактозу. Они выделяются при кишечных инфекциях человека (брюшном тифе, дизентерии и др.) в период выздоровления. Наибольшее санитарно-показательное значение имеют кишечные палочки, не растущие на среде Козера (цитратная среда) и ферментирующие углеводы при 43-45°С (E. coli).Они являются показателем свежего фекального загрязнения.

Заболевания, вызываемые у человека E.coli

Кишечные заболевания, вызываемые патогенными E.coli объединяются общим названием эшерихиозы. Используются также термины коли-инфекция, коли-энтерит, диарея путешественников, колибактериоз.

Эшерихиоз относится к острым кишечным заболеваниям (ОКИ) с фекально-оральным механизмом заражения. Каждый из вышеперечисленных классов патогенных E.coli характеризуется определенными различиями в протекании болезни, которая по своим симптомам может напоминать холеру или дизентерию. Инкубационный период длится 3-6 дней (чаще 4-5 дней).

Носители и распространение

Как уже упоминалось, бактерии E.Coli входят в состав нормальной кишечной флоры не только человека, но и крупного рогатого скота, свиней. Молодняк последних часто заражается колибактериозом и, соответственно, их мясо (говядина или свинина) может служить источником заражения. Подвержены этому заболеванию и домашние животные (собаки, кошки), однако основным способом заражение является все-таки фекальное загрязнение питьевой воды или продуктов питания.

Опасность для человека

Инфицирующая доза сильно зависит от типа патогенной кишечной палочки (так для энтеротоксигенной E.coli эта величина может составлять от 100 миллионов до 10 миллиардов бактерий, в то время как для энтероинвазивной и, предположительно, энтерогемморагической E.coli - всего 10 организмов, как и у Shigella). В наибольшей степени восприимчивы к заболеванию дети раннего возраста, пожилые и ослабленные люди.

У детей эшерихиоз протекает в виде различной тяжести энтеритов, энтероколитов в сочетании с синдромом общей интоксикации. При средних и тяжелых формах сопровождается повышением температуры, поносом, сепсисом.

У взрослых заболевание, вызванное E.coli, напоминает по течению и клиническим симптомам острую дизентерию. Протекает чаще в стертой и легкой формах, реже (15-20%) встречается среднетяжелая и тяжелая (3%) формы.

Прогноз у взрослых и детей старше года благоприятный, наиболее тяжело заболевание протекает у детей первого полугодия жизни.

Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуцентов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин - введена неконьюгативная, немобилизуемая плазмида p Сolap, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Полученный штамм лишен нежелательного адгезивного фенотипа инактивированием гена адгезина fimH пилей 1-го типа интеграцией гена устойчивости к канамицину - неомицину npt. Штамм E.coli М17 fim H::Kan/p Colap депонирован в ВКПМ под номером В-7448, Это позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Введенные в сконструированный штамм признаки стабильно сохраняются в популяции. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 4 ил., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243]. В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52-54]. Однако, в отличие от исходного штамма штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л.Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16]. Другим недостатком штамма Е.coli М17 и его предшественника является наличие у них высокоадгезивного М н фенотипа фимбрий 1-го типа, необычного и нежелательного для кишечного штамма. Такой фенотип часто обнаруживается у выделяемых из макроорганизма штаммов при инфекции мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е. coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения. Задачей изобретения является создание штамма Е.coli - производного E.coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е. coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, нежелательный адгезивный фенотип, чувствительность к антибиотикам. Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью, сниженной способностью к колонизации отличных от первичной интестинальной ниш в макроорганизме и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда. Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap, который продуцирует колицин E1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл) и содержит инактивированный ген fimH, кодирующий фимбриальный адгезин. Штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7448. В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что инактивирование гена адгезина fimH пилей 1-го типа в геноме Escherichia coli штамма М17 и введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина E1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется чертежами, где:

На фиг. 1 показана схема получения рекомбинантного штамма E. coli M17fimH::kan/pColap с дефектом в гене адгезина fimH пилей 1-го типа,

На фиг. 2 - схема конструирования гибридной плазмиды pColap,

На фиг. 3 приведены результаты исследования адгезивной активности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap,

На фиг. 4 - результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap. При получении штамма Е.coli М17 fimH::kan/pColap в качестве исходного использовали его ближайший аналог - штамм Е.coli М17. Для элиминации фимбриального адгезина, сообщающего клеткам Е.coli М17 нежелательный высокоадгезивный М н фенотип, получали рекомбинантный штамм, у которого в хромосомный ген fimH, кодирующий адгезин, был интегрирован ген устойчивости к канамицину-неомицину npt. С этой целью использовали плазмиду pCH103, производную плазмиды R6K, которая имеет pir-зависимую систему репликации и может поддерживаться только в штаммах, содержащих ген pir, обеспечивающий ее репликацию [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Плазмида pCH103 несет ген устойчивости к ампициллину и фрагмент хромосомы, содержащий гены fim-кластера, в котором целостность гена fimH нарушена вставкой гена устойчивости к канамицину (неомицину) npt. После трансформации ее в штамм Е.coli М17 она не может поддерживаться в клетках, и устойчивые к канамицину трансформанты могут возникать или при интеграции ее целиком в хромосому в результате одного кроссинговера или в результате двойного кроссинговера (фиг. 1). Трансформанты второго класса остаются чувствительными к ампициллину. Среди них был отобран штамм, обозначенный Е.coli M17fimH::kan (или М17 fimH::npt). Проведенное исследование подтвердило отсутствие у полученного штамма маннозо-чувствительной адгезии, т.е. FimH - фенотип. Для повышения антагонистической активности штамма Е. coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина E1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1, эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез - лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена - лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5" - участке, повышающем эффективность экспрессии , произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap. Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации -лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е. coli М17 fimH::kan и получили штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap. Штамм имеет следующие характеристики. Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера. Через 36 ч роста при 37 o C образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются. Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%). Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями. Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера. Через 18-24 ч роста при 37 o C наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах. Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %). Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах слабый или отсутствует. Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом. Отношение к температуре и pH среды. Хорошо растет при температуре от 30 до 42 o C и при pH 6,8 - 7,2. Биохимические свойства. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает. Отношение к антибиотикам. Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л. Продукция бактериоцинов. Продуцирует колицин E1. Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина E1. Штамм имеет антигенную формулу О2:L1:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000. Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования. Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина (табл. 1). Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37 o C с аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10 -7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6 % агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена - лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17 fimH::kan/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину. Пример 2. Исследование адгезивных свойств и определение адгезивного фенотипа штамма Е. coli М17 и его производных. Адгезивный фенотип определяли стандартным методом "исследования роста" . Из свежей культуры исследуемых штаммов бактерий готовили суспензию бактериальных клеток в физиологическом растворе с оптической плотностью 1.0 при длине волны 540 нм. Параллельно приготовили планшеты для микротитрования с плоскодонными лунками с иммобилизованными в лунках субстратами для адгезии, а именно: МН (дрожжевой маннан), РН (бычья РНКаза В) и БСА (бычий сывороточный альбумин). Затем бактериальную суспензию помещали в лунки и инкубировали в течение 40 мин. Несвязавшиеся бактериальные клетки тщательно отмывали физиологическим раствором. В лунки добавляли богатую питательную среду и инкубировали с постоянным перемешиванием при 37 o C в течение 2,5 - 3 ч до появления помутнения в лунках. Оптическая плотность в каждой лунке учитывалась на автоматическом ридере микропланшет (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA). В данном эксперименте исследовались следующие штаммы Е.coli: М17 - исходный штамм; М17 fimH::kan - штамм М17 с инактивированным геном адгезина fimH: М17 fimH: : kan/pPKL91 - штамм fimH::kan, трансформированный плазмидой pPKL91, содержащей регуляторный ген fimB, включающий экспрессию пилей 1-го типа бактериальной клеткой; штамм M17fimH::kan/pColap - штамм М17 fimH::kan, трансформированный сконструированной нами плазмидой pColap, несущей детерминанты устойчивости к ампициллину и продукции колицина Е1. Результаты исследования адгезивной активности штаммов Е.coli М17 и производных штамма Е.coli М17, оцененной с помощью метода "исследования роста", представлены на фиг. 3 (по оси ординат отложены значения оптической плотности при длине волны 540 нм; на оси абсцисс - исследуемые штаммы Е. coli: 1 - М17; 2 - М17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - М17 fimH::kan/pColap). Как видно из фиг. 3, исходный штамм Е. coli М17 хорошо связывается и с РНКазой B, и с маннаном, что указывает на МН адгезивный фенотип, нежелательный для интестинального штамма кишечной палочки. Полученный нами рекомбинантный штамм М17 fimH::kan проявляет нулевую адгезивную активность как сам по себе, так и после введения в него плазмиды, включающей экспрессию пилей 1-го типа. Нулевая адгезиная активность сохраняется в этом штамме и после введения в него плазмиды pColap (штамм М17 fimH::kan/pColap). Пример 3. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, детерминируемых плазмидой pColap. Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков. Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColE1, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColE1, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид. Культуры штаммов М17 fimH::kan/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37 o C в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10 o бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10 6) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали, как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента. Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. "Эксперименты в молекулярной генетике", М. , "Мир", 1976, стр. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6 % агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37 o C в течение 3 - 4 ч, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 с и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл полужидкого (0,7 %) агара, содержащего 10 7 /мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37 o C. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину). Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях. Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны, гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17 rimH::kan/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap ВКПМ В-7448, используемый для получения пробиотического препарата.