Иммунологические реакции: агглютинации, преципитации, лизиса. Серологические реакции Применение иммунологических реакций в медицинской практике

Способность организма противостоять внешним воздействиям и сохранять при этом постоянство внутренней среды связана как с функционированием механизмов неспецифической защиты, так и с возможностью развивать высокоспециализированную форму реакции - иммунный ответ. Иммунная система играет важную роль в сложном механизме адаптации человеческого организма, обеспечивая сохранение антигенного гомеостаза, нарушение которого может быть обусловлено проникновением в организм чужеродных антигенов или спонтанной мутацией. Механизмы, направленные на элиминацию чужеродного агента, чрезвычайно разнообразны. При этом можно выделить два понятия: «неспецифические факторы защиты» и «иммунологическая реактивность».

Под неспецифической резистентностью понимают способность организма противостоять действию чужеродных агентов выработанными в процессе эволюции стереотипными механизмами. Они первыми защищают организм, давая ему время на формирование полноценного иммунного ответа. Защищенность организма от инфекций зависит от степени проницаемости для патогенных микроорганизмов кожи и слизистых, наличия в их секретах бактерицидных субстанций, кислотности желудочного содержимого. Механизмы неспецифической резистентности разделяют на клеточные и гуморальные. Клеточные реакции представлены фагоцитозом, который осуществляют, в основном, нейтрофилы и макрофаги.

К гуморальным факторам относятся система комплемента, лизоцим, белки острой фазы воспаления, интерфероны и др. Все эти механизмы относятся к неспецифическим факторам защиты потому, что существуют вне зависимости от присутствия или отсутствия возбудителя. Однако несмотря на неспецифичность фагоцитоза, макрофаги участвуют в переработке антигена (АГ), в кооперации Т- и В-лимфоцитов при иммунном ответе, т. е. в специфических формах реагирования на чужеродные субстанции.

Аналогично выработка комплемента не является специфической реакцией на антиген, но классический путь активации системы комплемента инициируется комплексом антиген–антитело.

Иммунологическая реактивность - это способность организма отвечать на действие антигена специфическими по отношению к нему клеточными и гуморальными реакциями. Эта способность обусловлена существованием двух видов иммунных клеток: Т-лимфоцитов, которые непосредственно реагируют с антигеном и осуществляют клеточные иммунные реакции, и В-лимфоцитов, превращающихся под действием антигена в плазматические клетки, которые вырабатывают иммуноглобулины, ответственные за гуморальные иммунные реакции. Т- и В-лимфоциты несут на своей поверхности специфические рецепторы для распознавания антигенов.

При поступлении антигенных веществ в организм осуществляется:

презентация и распознавание антигена;

размножение Т- и В-лимфоцитов клона, несущего рецепторы или продуцирующего антитела против этого антигена, заканчивающееся образованием субпопуляций лимфоцитов и антител;

специфическое взаимодействие субпопуляций Т-лимфоцитов и антител с антигеном;

образование комплексов антиген–антитело с участием лейкоцитов крови, биологически активных веществ, ускоряющих инактивацию антигена в организме;

формирование иммунной памяти;

предупреждение и угнетение выработки антител против компонентов собственного организма, т. е. индукция и поддержание иммунной толерантности к своим антигенам.

Клеточный иммунный ответ. Т-лимфоциты различаются по наличию маркерных антигенов (сейчас насчитывают уже более 10 типов Т-клеток). По способности к взаимодействиям с антигеном и другими лимфоцитами выделяют основные субпопуляции Т-лимфоцитов:

Т-хелперы, помогающие другим Т- и В-лимфоцитам реагировать на антиген (выделяют нескольких типов: Тх1, Тх2, Тх3, Тх17);

Т-регуляторы (супрессоры), тормозящие реакцию других лимфоцитов;

Т-киллеры, индуцирующие апоптоз в клетках-мишенях путем выделения цитотоксических лимфокинов, экспрессии на поверхности рецепторов «смерти» или выработки перфоринов (гранзимов).

Гуморальный иммунный ответ . В антигензависимый период В-лимфоциты крови и периферических органов иммунной системы стимулируются антигеном и оседают в В-зонах селезенки и лимфатических узлов (в фолликулах и центрах размножения), где претерпевают бласттрансформацию: из малых лимфоцитов превращаются в большие размножающиеся клетки, а затем в плазматические. В плазмоцитах происходит синтез иммуноглобулинов, которые поступают в кровь. У человека образуется пять классов антител (иммуноглобулинов): IgD, IgM, IgG, IgA, IgE.

Специфичность взаимодействия с антигеном достигается соответствием активного центра антитела детерминанте антигена. Благодаря совокупности механизмов, обеспечивающих мутацию и разнообразие вариабельных участков, их рекомбинацию, организм реагирует на огромное количество

разнообразных антигенов.

Высокая степень ответа на антиген обусловлена одновременным развитием клеточных и гуморальных иммунных реакций различных типов, а также поликлональностью иммунного ответа на конкретный антиген. Этот эффект объясняется кооперацией макрофагов, Т- и В-лимфоцитов,

размножением клеток клонов при стимуляции антигеном. Развитие эффективного иммунного ответа возможно только в кооперации с клетками микроокружения: эндотелием сосудов, клетками стромы (дендритные, тучные клетки, фибробласты, макрофаги и т. д.), которые формируют цитокиновый фон и участвуют в формировании очага воспаления. В качестве медиаторов кооперации при иммуногенезе вырабатываются интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей (ФНО), хемокины, интерлейкины, а также колониестимулирующие факторы и факторы роста эпидермиса, гранулоцитов, макрофагов, сосудов, нервов.

Эффективность разрушения антигенов, ассоциированных с клетками, в процессе иммунных реакций обусловлена факторами, способными убивать соответствующие клетки. Реакции киллинга включают: индукцию апоптоза клеток-мишеней Т-киллерами, продукцию цитотоксических цитокинов, антителозависимую клеточную цитотоксичность, комплементзависимую цитотоксичность.

По отношению к потенциальным антигенам своего организма развивается иммунная толерантность (специфическая переносимость, ареактивность). Она формируется в течение всей жизни. При этом в результате мутаций генов в организме образуются новые клоны Т- и В-лимфоцитов, в т. ч. и те, которые способны реагировать со своими антигенами. В вилочковой железе такие клоны Т-лимфоцитов элиминируются. Запретные клоны В-лимфоцитов, нетолерантные к антигенам своего организма, или тормозятся по типу высокодозовой толерантности, или остаются незаторможенными. Оказалось, что у здоровых людей часть В-лимфоцитов не толерантна к антигенам своего организма. Однако аутоиммунный процесс при этом не возникает, т. к. без Т-хелперов В-лимфоциты не стимулируются антигеном.

В основу реакций иммунитета положено специфическое взаимодействие антигена с антителом. С помощью известных антигенов можно определить наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого лица (серологическая диагностика инфекционных заболеваний). И, наоборот, наличие специфических иммунных сывороток позволяет установить родовую, видовую и типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Агглютинация – склеивание микробов или других клеток при воздействии на них иммунной сыворотки, содержащей антитела – агглютинины. Реакция агглютинации проявляется в том, что равномерной взвеси клеток, например бактерий, при добавлении иммунной сыворотки происходит скручивание клеток, образование зернышек или хлопьев, которые постепенно оседают на дно, жидкость же над осадком совершенно просветляется. Однако зернышки или хлопья образуются только в том случае, если реакция происходит в присутствии электролитов. Таким образом, для проявления реакции агглютинации нужно иметь: 1) антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток; 2)антитела (агглютинины) в виде иммунной сыворотки; 3) электролиты (физиологический раствор).

Внешнее проявление положительной реакции агглютинации бактерий имеет двоякий характер в зависимости от свойств антигена: у безжгутиковых бактерий, имеющих только один соматический или О-антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток, и образующиеся кучки имеют вид мелких компактных зерен. Такая агглютинация называется тонкозернистой; она происходит медленно – в течение 18-22 часов. У бактерий со жгутиками имеются два антигена – соматический, О-антиген, в самой клетке и жгутиковый, Н-антиген, находящийся в жгутиках. Клетки склеиваются друг с другом жгутиками и образуют рыхлые крупные хлопья. Такая агглютинация называется крупнохлопчатой; она наступает быстро – в течение 2-4 часов.

Реакция аггютнации благодаря своей специфичности, простоте и постановке и демонстративности получила широкое распространение в микробиологической практике для диагноза многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа, сыпного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, бруцеллеза и др. Ею пользуются с диагностической целью в 2 направлений.

1. Для определения выделения выделенного из какого-либо субстрата неизвестного микроба. В этом случае агглютинацию ставят с определенной, заранее приготовленной агглютинирующей сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов определенным видом бактерий и, следовательно, содержащей агглютинины в отношении этих бактерий.

В качестве антигена берут культуру неизвестного исследуемого микроба. Положительный результат реакции указывает, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления агглютинирующей сыворотки.

2. Для обнаружения агглютининов к тому или другому определенному виду бактерий в сыворотке больного. В этом случае для агглютинации берут определенную лабораторную культуру бактерий (или несколько культур бактерий разных видов) в качестве в качестве антигена и сыворотку больного. Положительный результат агглютинации указывает на то, что сыворотке больного имеются агглютинины к определенному, известному, виду микроба, т.е. данный микроб является возбудителем заболевания, в процессе которого в сыворотке больного накопились защитные антитела.

Механизм: «теория решетки».

Активный центр АТ соединяется с 1 антигенной детерминантой, 2-ой активный центр реагирует с антигенной детерминантой, находящейся на 2 молекуле АГ, в результате происходит склеивание. Если в качестве АТ взята безжгутиковая бактерия, то зернистость мелкая – агглютинация., если жгутиковая – Н-агглютинация (крупная зернистость).

Варианты агглютинации:

1. Ориентировочная на стекле – для выявления серологических свойств бактерий, для выявления признаков, для идентификации.

2. Развернутая в пробирках – мало чувствительна и невысоко специфична. Определяется титр АТ (это максимальное разведение сыворотки, в которой обнаружена агглютинация).

3. РНГА (нагрузочная реакция) – реакция непрерывной Геной агглютинации – используется АГ, абсорбированный на эритроцитах барана, т.о. перевод из растворимого в корпускулярный – агглютинация эритроцитов.

Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовится путем иммунизации кроликов.

Сыворотка от больного для постановки реакции агглютинации получается из его крови, взятой стерильно на локтевой вене в количестве 5-10 мл. одновременно часть крови употребляется для посева. Если же кровь нужна только для постановки реакции, вполне достаточно 1-2 мл. тогда берут кровь из пальца проколом иглой Франка.

АГ для реакции агглютинации являются соответствующие живые ил убитые культуры бактерий. Живыми культурами пользуются тогда, когда агглютинация ставится с целью определения вида бактерий, выделенных из какого-либо субстрата.

Диагностикумы – диагностические препараты, содержащие АГ и используемые для обнаружения АТ.

24 Реакция преципитации и ее значение, область применения. Методы постановки. Преципитирующие сыворотки, их получение и титрование. Использование реакции преципитации в диагностике инфекций.

Реакции преципитации основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии АГ с АТ. РП позволяют выявлять незначительные количества АГ. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси с АГ. Метод имеет много разновидностей.

Реакция кольцепиципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую АГ, и чрез несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата.

Реакции микропреципитации применяют для нефелометрического выявления АТ в небольших образцах сыворотки.

Преципитация в геле – на агаре с ее помощью определяют токсигенность выделенных бактерий. При дифтерии, стаф.токсикозе, для определения клеточного иммуноглобулина в сыворотке крови.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить минималейшие следы белка – антигена (до разведения 1:100000 и выше), благодаря чему преципитация практически стала важной реакцией в химии, биологии и т.д.

Чрезвычайно большое значение реакция преципитации имеет в судебномедицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови не только в свежем и жидком состояниях, но также и в высушенном, например, в пятнах очень давнего происхождения на одежде.

В санитарной практике реакция преципитации является методом для определения фальсификации мясных, мучных и других препаратов.

Для серологического диагноза пользуются реакцией преципитации в тех случаях, когда АГ может быть получен только в жидком состоянии, например в вытяжке из инфицированных органов, в спинномозговой жидкости, в моче больного и т.д.

Реакции преципитации можно ставить как с веществами белковой природы – полноценными АГ, так и гаптенами – неполноценными АГ, которые сами по себе не могут вызывать образование АТ, но могут вступать в соединение с ними.

Постановка реакции. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

1. преципитирующую сыворотку, приготовленную путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном;

2. исследуемый АГ в виде отцентрифугированного или профильтрованного прозрачного раствора (экстракт их микробных тел, патологических субстратов от больного, органов, кровяных пятен, сывороточные белки и т.д.) Перед постановкой реакции разводят АГ – физиологическим раствором не менее чем на 1:1000;

3. физиологический раствор (для разведения сыворотки и АГ);

4. специальные узкие (не шире 0,75 см) пробирки с конусообразным дном и очень прозрачного стекла;

5. пастеровские пипетки;

Обязательным условием является полная прозрачность участвующих в реакции агглютинации ингредиентов – сыворотки и АГ. В противном случае результаты реакции будут не ясны.

В пробирку наливают 0,2 мл преципитирующей сыворотки; затем при помощи пастеровской пипетки осторожно наслаивают на сыворотку 0,2 мл АГ (спускают жидкость по стенке пробирки так, чтобы она не смешивалась с сывороткой, а образовала над ней верхний слой). Добавив АГ. Пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции сразу же или в течение 5-10 минут на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо от выпавшего в осадок АГ. Степень реакции оценивается по величине кольца и времени его проявления.

К опыту ставится несколько контролей, а именно: 1) заведомо известны АГ + специфическая преципитирующая сыворотка; 2) преципитирующая сыворотка + физиологический раствор; 3) нормальная сыворотка + исследуемый АГ.

25 Реакция иммунного лизиса как один из механизмом иммунитета. Компоненты реакции, практическое использование.

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки при инфекции является ее способность растворять (лизировать) м/о или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят названия лизинов. В зависимости от АГ они точнее называются бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами и т.д.

Лизины способны проявлять свое лизирующее действие на АГ только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент является составной частью любой свежей сыворотки, как нормальной, так и иммунной. При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается.

Т.о. реакция лизиса происходит при участии двух компонентов: одного специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (АТ), и другого неспецифического, присущего любой сыворотке, как иммунной, так и нормальной (комплемент).

Свежеизвлеченная из организма иммунная сыворотка способна к лизису, так как содержит и АТ и комплемент. Если же пользуются иммунной сывороткой, стоявшей или подвергнутой подогреванию и вследствие этого утратившей комплемент, то лизис произойдет только при условии добавления комплемента, т.е. свежей сыворотки. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее инактивируют нагреванием при 56 градусов в течение 30 минут (для разрушения имеющегося в ней комплемента) и прибавляют к ней строго определенное количество комплемента. В качестве комплемента принято пользоваться свежей сывороткой нормальной морской свинки.

При дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.

26. Реакция связывания комплемента в диагностике инфекционных заболеваний. Практическое применение, компоненты реакции.

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения АГ в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, так и растворимых Г. Последнее связано с тем, что комплемент связывается с Fc- фрагментом АТ независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом АГ-АТ за счет Fc-фрагментов последнего и на вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия.

Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплиментарность.

Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при температуре 37 градусов в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Т.о в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой АГ-АТ, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой АГ-АТ, т.е на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкратной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++

27 Неполные антитела. Реакция Кумбса (прямая и непрямая). Обнаружение антител к резус фактору у беременных женщин.

Неполные АТ – АТ, имеющие только один активный центр – являются одновалентными.

Реакция Кумбса.

Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллезе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) АТ.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

Иммунофлюоресценция

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель, дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –

отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании

препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и

наличие и титр специфических антител. Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой

иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.

29. Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины, вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов, для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,

поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН in vivo может быть использована для определения степени напряженности антитоксического иммунитета в организме человека (проба Шика).

Токсин – яд микробного происхождения. Токсины микробов делятся на эндотоксины и экзотоксины. Характеристика токсинов см. тема №6.

Анатоксин – обезвреженный токсин. Получают из экзотоксинов путем их обработки формалином и теплом. Анатоксин не обладает ядовитостью, при этом сохраняет антигенные и иммуногенные свойства токсина. Сила

действия анатоксина измеряется в ИЕ. ИЕ (иммуногенная единица) – это такое количество анатоксина, которое в смеси с 1 АЕ сыворотки дает инициальную флоккуляцию. Титр анатоксина – количество ИЕ в 1 мл.

Анатоксины титруют в реакции флоккуляции. Анатоксин используется в качестве вакцины для создания активного антитоксического иммунитета. Примером таких вакцин являются дифтерийный анатоксин, столбнячный

анатоксин и др. Анатоксин используется также дл получения антитоксических сывороток.

Антитоксин или антитоксическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к токсину. Антитоксические сыворотки – это гетерологичные сыворотки, их получают путем гипериммунизации лошадей соответствующими анатоксинами с последующим взятием у животных крови и получения сыворотки. Содержание антитоксина в антитоксических сыворотках выражается в международных единицах (ME), принятых ВОЗ. Например, 1 ME противостолбнячной сыворотки соответствует ее

минимальному количеству, нейтрализующему 1000 минимальных смертельных доз (DLm) столбнячного токсина для морской свинки массой 350 г. 1 ME противоботулинического антитоксина - наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее 10000 DLm ботулинического токсина для мышей массой 20 г. 1 ME противодифтерийной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 100 DLm дифтерийного токси-на для морской свинки массой 250 г.

30. Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм РФ сходен с таковым реакции преципитации. В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки

31. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод являетсянеконкурентным . Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным .

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

1. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антигенконкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные типы тест-систем (диагностических наборов) в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

1. Лизатные - в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

2. Рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

3. Пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Теории иммунитета

1) Эрлиха теория иммунитета (теория боковых цепей) - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена.

2) Клонально-селективная теория , теория Бернета - теория, согласно которой в организме возникают клоны клеток, иммунокомпетентных в отношении различных антигенов; антиген избирательно контактирует с соответствующим клоном, стимулируя выработку им антител.

1. Антитела и лимфоциты с необходимой специфичностью уже существуют в организме до первого контакта с антигеном.

2. Лимфоциты, участвующие в иммунном ответе, имеют антигенспецифичные рецепторы на поверхности своих мембран. В случае B-лимфоцитов рецепторами являются молекулы той же специфичности, что и антитела, которые эти лимфоциты впоследствии продуцируют и выделяют.

3. Каждый лимфоцит несет на своей поверхности рецепторы только одной специфичности.

Лимфоцит, сенсибилизированный антигеном, проходит несколько стадий пролиферации и формирует клон плазматических клеток. Плазматические клетки синтезируют антитела только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцит-предшественник. Сигналами к пролиферации служат связывание антигена и цитокины, выделяемые другими клетками (в первую очередь, Т-хелперами. Сами активированные В-лимфоциты также выделяют цитокины.

3) Селективную теорию образования антител сформулировал Ерне, он предположил, что в организме синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде естественных антител. Функция их состоит в том, чтобы избирательно связываться с соответствующим антигеном и таким способом доставлять его неким клеткам организма, для которых они служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, т.е. к образованию антител. Это была первая теория, которая объясняла также феномен иммунологической толерантности, принимая, что любые естественные антитела направленные против собственных антигенов будут немедленно абсорбироваться тканями организма, и таким образом не могут запустить образование аутоантител.

34. Иммунологи́ческая толера́нтность - способность иммунной системы специфически не реагировать на конкретный антиген. Например, при беременности развиваетсятолерантность иммунной системы матери

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;

Двумя основными типами иммунных реакций являются врожденная реакция и адаптивная (приобретенная) реакция. Врожденная реакция , которая осуществляется с помощью нейтрофилов, макрофагов, тучных клеток и естественных киллеров, развивается быстро, является неспецифической и более старой с эволюционной точки зрения. Она не связана с образованием клеток памяти. Адаптивная приобретенная реакция, которая зависит от начального распознавания антигенов В- и Т-клетками, значительно более сложная, она возникает более медленно, является специфической, сопровождается образованием клеток памяти и считается более недавним эволюционным приобретением.

Иммунный ответ происходит в результате взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток и цитокинов. Он включает 4 фазы: распознавание антигена, активация, пролиферация и дифференцировка клеток.

Адаптивные механизмы, которые приводят к устранению антигенов, разделяются на гуморальный и клеточный иммунитет. Гуморальный иммунитет обеспечивается антителами, которые вырабатывают плазматические клетки, происходящие из клонов активированных В-лимфоцитов.

Клеточный иммунный ответ формируется при трансплантации органов и тканей, инфицировании вирусами, злокачественном опухолевом росте. Клеточный иммунитет проявляется двумя основными типами реакций - цитотоксичность и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) . В клеточном иммунитете участвует цитотоксическая клетка (Тк), реагирующая с антигеном в комплексе с белками МНС I класса в плазматической мембране клетки-мишени.

Цитотоксические реакции протекают следующим образом: цитотоксическая Т-клетка убивает клетку, инфицированную вирусом, в том случае, если она узнает с помощью своих рецепторов фрагменты вирусных белков, связанные с молекулами МНС I класса на поверхности зараженной клетки-мишени. Связывание цитотоксической клетки с клетками-мишенями ведет к высвобождению ими порообразующих белков, называемых перфоринами , которые полимеризуются в плазматической мембране клетки-мишени в присутствии Са 2+ , превращаясь в трансмембранные каналы (поры). Через эти поры внутрь клетки-мишени поступают другие белки, секретируемые Тк-гранзимы . Те, в свою очередь, активируют внутриклеточные ферменты каспазы . Последние включают сигналы для развития апоптоза. Сам Т-киллер защищен от цитотоксического действия перфорина. Механизм самозащиты неизвестен.

Реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). В этих реакциях принимают участие макрофаги и Тх. Эти реакции развиваются через несколько суток после воздействия антигена: происходит уплотнение и воспаление ткани в результате ее инфильтрации Т-лимфоцитами и макрофагами. ГЗТ вызывается Т-хелперами (СD4+), которые секретируют цитокины (ИФН-γ), активирующие макрофаги, и индуцируют воспаление (ФНО - фактор некроза опухоли).

При ГЗТ повреждение ткани происходит в результате действия продуктов активированных макрофагов, таких как гидролитических ферментов, промежуточных продуктов кислорода и цитокины. При хронических ГЗТ часто образуется фиброз как результат секреции цитокинов и факторов роста макрофагов.

Лекарства, косметические препараты могут соединятся с белками ткани, образуя комплексный антиген, с развитием контактной ГЗТ. Инфекционные болезни (бруцеллез, туляремия, туберкулез, лепра, токсоплазмоз, многие микозы и др.) сопровождаются развитием ГЗТ, поэтому при диагностики используют кожно-аллергические пробы с аллергенами возбудителей (например, реакция манту).

Гуморальный иммунный ответ (антителообразование) развивается в организме в ответ на антигены, расположенные внеклеточно. В нем участвуют макрофаги (антигенпрезентирующие клетки), Тх и В-лимфоциты. Данный ответ проходит следующим образом.

Попавший в организм антиген поглощается макрофагом. Макрофаг расщепляет его на фрагменты, которые в комплексе с молекулами МНС класса II появляются на поверхности клетки. Такая обработка антигена макрофагом называется процессированием антигена.

Для дальнейшего развития иммунного ответа на антиген необходимо участие Тх(хелперов). Но прежде Тх должны быть активированы сами. «Узнавание» Тх-клеткой комплекса «антиген + молекула МНС II класса» на поверхности макрофага стимулирует секрецию интерлейкина-1 (ИЛ-1) макрофагом. Под воздействием ИЛ-1 активизируются синтез и секреция ИЛ-2 Тх-клеткой. Выделение Тх-клеткой ИЛ-2 стимулирует ее пролиферацию Тх (хелперов). Такой процесс может быть расценен как аутокринная стимуляция, так как клетка реагирует на тот агент, который сама синтезирует и секретирует. Увеличение численности Тх необходимо для реализации оптимального иммунного ответа.

Тх активируют В-клетки путем секреции ИЛ-2. Активация В-лимфоцита происходит также при прямом взаимодействии антигена с иммуноглобулиновым рецептором В-клетки. В-лимфоцит сам процессирует антиген и представляет его фрагмент в комплексе с молекулой МНС II класса на клеточной поверхности. Этот комплекс узнает уже задействованный в иммунной реакции Тх (рисунок 11). Узнавание рецептором Тх-клетки комплекса «АГ + молекула МНС II класса» на поверхности В-лимфоцита приводит к секреции Тх-клеткой интерлейкинов - ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, γ-ИФН (γ-интерферона), под действием которых В-клетка размножается и дифференцируется с образованием плазматических клеток и В-клеток памяти. Так, ИЛ-4 инициирует активацию В-клетки, ИЛ-5 стимулирует пролиферацию активированных В-клеток, ИЛ-6 вызывает созревание активированных В-клеток и превращение их в плазматические клетки, секретирующие антитела.

Интерферон привлекает и активирует макрофаги, которые начинают более активно фагоцитировать и разрушать внедрившиеся микроорганизмы.

Передача большого количества переработанных макрофагом антигенов обеспечивает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов в направлении образования плазмоцитов, вырабатывающих специфи-ческие антитела на конкретный вид антигена (рисунок 13).

Подводя итог, следует отметить: клеточные и гуморальные реакции не работают автономно. Как правило, в организме одновременно реализуются оба типа иммунного ответа. Распознавание Т- и В-клетками различных по своей природе антигенов, многообразие реакций и форм ответа обеспечивают в целом мощную защиту организма в течение его жизни.

Ниже приведены рисунки, где показаны взаимодействия иммуннокомпетентных клеток при клеточном и гуморальном иммунитете.

Рисунок 13 - Основные процессы, происходящие при иммунной реакции

Иммунологические методы исследования – диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для:

Определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов,

Видовой принадлежности белка,

Распознавания аллергии и аутоиммунных болезней,

Беременности,

Гормональных нарушений, а также

В научно-исследовательской работе.

Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе И. м. и. изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек - носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.