Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева. Задания

Методы контроля дрожжей

Определение бродильной активности весовым методом

Весовой метод заключается в определении количества выделившегося диоксида углерода по разности между массой сусла до и после брожения.

Подсчет числа клеток микроорганизмов под микроскопом

Для подсчета микроорганизмов обычно используют камеры Тома-Горяева. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечно расположенные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована сетка. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла. Сетка камеры разделена на 225 больших квадратов (15 рядов и 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата равна 1/25 мм и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна 1/20 мм, площадь - 1/400 мм кв., объем при глубине 0,1 мм - 1/4000 мм куб. Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена.

Подсчет дрожжей в жидких субстратах ведут после предварительного разбавления водой. Заполнение камеры осуществляют в определенном порядке: небольшую каплю исследуемой суспензии наносят на поверхность счетной камеры и покрывают шлифованным плоскопараллельным покровным стеклом. Для соответствия расчетного значения объема камеры и объема находящейся в ней суспензии клеток покровное стекло притирают к сторонам камеры путем смещения его в противоположные стороны несколько раз. Вначале можно притереть покровное стекло, а затем из пипетки осторожно заполнить камеру суспензией дрожжей. Подсчет клеток рекомендуется начинать не раньше чем через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости.

Подсчет числа клеток проводят с объективом 8х или 40х. Число клеток дрожжей обычно подсчитывают в 10 больших квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете число клеток в большом квадрате не должно превышать 20, в противном случае исходную суспензию дрожжей разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Число клеток в 1 см куб. исходной суспензии:

M = a x 1000 / h x S x n,

где: а - среднее число клеток в квадрате сетки;
h - глубина камеры, мм;
S - площадь квадрата сетки, мм кв.;
n - разведение исходной суспензии;
1000 мм куб. = 1 см куб.

Определение морфологического состояния клеток

Морфологическое состояние клеток определяют путем микроскопирования. Дрожжи должны иметь форму и размеры, соответствующие применяемой расе. Клетки должны быть равномерной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями.

Определение биологической чистоты

Для оценки биологической чистоты дрожжей микроскопирование проводят следующим образом: к дрожжевой суспензии для растворения белков прибавляют одну каплю 10%-ного раствора щелочи. Препарат просматривают под микроскопом не менее, чем в 20 полях зрения. В каждом поле зрения должно быть около 50 клеток. Таким образом просматривают 1000 дрожжевых клеток и определяют содержание диких дрожжей и бактерий. Годными считаются семенные дрожжи, которые содержат не более 1% бактерий и 0,5% диких дрожжей.

Определение числа мертвых клеток (окраска по Финку)

Определение числа мертвых клеток проводят микроскопированием, окрасив препарат раствором метиленового синего с рН=4,6, в котором число окрашенных клеток соответствует действительному числу мертвых клеток в суспензии дрожжей. На предметное стекло наносят одну каплю дрожжевой суспензии и одну каплю краски и накрывают покровным стеклом. Подсчитывают количество всех клеток и в их числе клетки, окрашенные в синий цвет, в 10 полях зрения препарата и вычисляют содержание мертвых клеток в процентах. В хороших семенных дрожжах содержится не более 10% мертвых клеток.

Определение способности дрожжей к размножению

Способность дрожжей к размножению характеризует количество почкующихся клеток. Число клеток с почками подсчитывают под микроскопом в 10 полях зрения и выражают в процентах к общему количеству. Активно размножающиеся дрожжи содержат 40-70% почкующихся клеток. Определение пособности дрожжей к оседанию (метод ЧССР) Для определения способности дрожжей к оседанию сухие пивоваренные дрожжи в количестве 3 г смывают физиологическим раствором (0,85%-ный раствор поваренной соли) в мерный цилиндр вместимостью 500 cм3 и диаметром 5 см и доливают до объема 400 cм3. После взбалтывания в течение 1 минуты цилиндр оставляют в покое и через 12 минут определяют объем осевших дрожжей.

Хорошие хлопьевидные дрожжи за это время образуют осадок толщиной не менее 28 мм.

Прислал: Владимир Майборода

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение

«Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных
производств и виноделие» всех форм обучения

УДК 543.062:579.23

Каменская, учет микроорганизмов: методические рекомендации к выполнению лабораторных работ по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» всех форм обучения / , .

где М – количество клеток в 1 мл суспензии;

a – среднее количество клеток в квадрате сетки;

h – высота камеры, мм;

S – площадь квадрата сетки, мм²;

10³ – коэффициент перевода [см³] в [мм³];

n – коэффициент разведения исследуемой суспензии.

1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах , при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях. Фильтрование пробы известного объема (от нескольких миллилитров до литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.

1.3.1 Приготовление фильтра

Для фильтрования выбирают фильтр, размер пор которого позволяет задерживать микроорганизмы, находящиеся в субстрате. Перед использованием фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления воздуха и остатков растворителей; воду следует два или три раза сменить (кипячение не должно быть слишком бурным, иначе фильтры будут скручиваться). Затем фильтр помещают на специальный держатель матовой стороной вверх и пропускают через него точно измеренный объем пробы.

Чем больше плотность клеток в исследуемом материале, тем меньше должен быть исследуемый объем, и наоборот. Клетки микроорганизмов, осевшие на фильтре, окрашивают карболовым эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную красителем, чашку закрывают крышкой и оставляют на время от 3 до 5 часов или на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином. Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перестанет ее окрашивать. После отмывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопии. На предметное стекло наносят каплю иммерсионного масла, помещают на него окрашенный мембранный фильтр так, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность мембранного фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.

1.3.2 Правила подсчета

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммерсионным объективом 90´ в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которые изложены для метода Виноградского – Брида. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

где М – количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;

а – количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);

s – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²;

F – площадь мембранного фильтра, мм²;

V – объем профильтрованной жидкости, мл;

106 – коэффициент перевода [мм²] в [мкм²].

1.4 Метод микрокультур

Метод позволяет получить быстрый ответ о биологическом состоянии объекта. Для получения микрокультур в центр стерильного предметного стекла с начерченной миллиметровой сеткой площадью

5 см² наносят определенный объем (0,05 мл) разведенной культуры. Сюда же прибавляют две или три капли питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45 ºС, перемешивают ее с посевным материалом и размазывают по всей поверхности сетки. Полученный препарат накрывают покровным стеклом, кладут в стерильную чашку и ставят в термостат при температуре от 30 ºС до 37 ºС на 8 ч. Затем его вынимают, подсушивают и микроскопируют. Колонии можно подкрасить метиленовым синим Леффлера, разбавленным в соотношении 1:4. Окрашенный препарат снизу протирают, мазок накрывают покровным стеклом и подсчитывают колонии под микроскопом.

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

питательные среды (метод Коха)

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы, которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

2.1.1 Приготовление разведений

Получить полный текст

Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или в 0,85%-ном растворе NaCL (физиологическом растворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.

2.1.2 Посев

Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом (рисунок 2) разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри от 15 до 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхности агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды, например, поместив чашки в термостат на 2…3 суток крышками вниз.

Рисунок 2 – Схема приготовления разведений и посева суспензии
микроорганизмов

В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают от двух до четырех параллельных высевов. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45…50 ºС среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2…4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15…20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45…50 ºС, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять.

2.1.3 Подсчет выросших колоний

Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1…15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

где М – количество клеток в 1 мл;

а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

V – объем суспензии, взятый для посева, мл;

10 – коэффициент разведения;

n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев.

2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений питательного субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Получить полный текст

2.2.1 Приготовление разведений

Разведения исходной суспензии готовят, как и для чашечного метода.

2.2.2 Посев и регистрация результатов

Стерильную среду предварительно разливают в пробирки (колбы)

и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4…5 последних, причем каждое разведение высевают в 3…5 повторностях (параллельных пробирках). Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное число микроорганизмов в единице объема рассчитывают по таблице Мак – Креди (таблица 1), разработанной на основании методов вариационной статистики.

Таблица 1 – Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии (по Мак – Креди)

Число-вая

Наиболее вероятное

число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок

Чис-ловая

Наиболее вероятное

число микроорганизмов при засеве параллельных

пробирок

Продолжение таблицы 1

Продолжение таблицы 1

Для этого первоначально составляют числовую характеристику , которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при высеве из двух последующих разведений. Затем по таблице 1 находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

2.2.3 Примеры расчета

Пример 1

Разведения исходной суспензии

Число засеянных пробирок

Числовая характеристика

Пример 2

Разведения исходной суспензии

Число засеянных пробирок

Число пробирок, в которых обнаружен рост

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов

Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии

3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ

Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологическим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании микроорганизмов на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.

Определение биомассы состоит из трех последовательных операций: доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения; отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; определение их массы. Чаще всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться определением сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить пустую центрифужную пробирку (фильтр), но не доводить ее массу до постоянного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.

до постоянного значения

Получить полный текст

С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри или центрифужные пробирки (не пластиковые!), помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение одного или двух часов при температуре от 80 до 85 ºС или от 90 до 100 ºС соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и быстро переносят в эксикатор с безводным хлористым кальцием (СаСL2) или концентрированной серной кислотой. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешивание. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют, соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее определениях не будут превышать десятых долей миллиграмма.

3.2 Отделение микроорганизмов от среды

В центрифужную пробирку наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чаще всего центрифугируют от 15 до 20 мин при 3…5 тыс. g. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной НСL на 1 л воды) и снова центрифугируют при том же числе оборотов. Супернатант сливают тотчас после остановки центрифуги. В противном случае часть осадка может быть потеряна.

Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтрованием. Бумажный фильтр помещают в стеклянную воронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры - от 5 до 10 мл. Осадок на фильтре многократно промывают подкисленной дистиллированной водой.

Для отделения бактерий используют мембранные фильтры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше величины клеток, биомассу которых определяют. Мембранный фильтр помещают на пористую пластинку специального держателя, вставленного в колбу. Чтобы ускорить фильтрование, установку подключают к водоструйному насосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной водой.

3.3 Определение биомассы

Чтобы определить массу сухих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же, что использовали и при определении массы пробирок или фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле:

где М – сухая биомасса, г/л;

А – масса центрифужной пробирки (фильтра) с осадком, г;

В – масса центрифужной пробирки (фильтра) без осадка, г;

V – объем культуральной жидкости, взятый для центрифугирования (фильтрования), мл.

НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости.

В основе метода лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием света клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны света и т. д.), поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять число клеток по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной.

Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью нефелометра, фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале от 540 до 650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток минимальное. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к занижению результатов.

В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выражают в показателях нефелометра. Однако чаще строят калибровочные кривые между величиной светорассеяния и числом клеток или сухой биомассой в единице объема. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину оптической плотности суспензий с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых методов количество клеток или биомассу. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащихся в 1 мл суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую.

Получить полный текст

5 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

количества микроорганизмов в сыром молоке (6часов)

Цель работы:

Ознакомиться с различными методами бактериологического исследования молока по определению общего количества микроорганизмов.

Задания:

1. Провести бактериологическое исследование различных проб молока: приготовить разведения 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1: 100000 и сделать посевы на мясопептонный агар (МПА) в чашках Петри.

3. Определить количество микроорганизмов в молоке косвенным методом (редуктазная проба).

4. Сделать учет результатов, их оценку и занести полученные данные в протокол.

Оборудование и материалы:

– стерильные пипетки на 1, 2, 10 мл;

– пробирки;

– чашки Петри;

– восковые карандаши;

– предметные стекла;

– пробы молока (свежего и длительного хранения);

– биологические микроскопы;

– водный раствор 2%-ной метиленового синего;

– стерильный МПА;

– водяная баня;

– колбы емкостью 150-250 мл.

Методические указания по теме

О санитарно-гигиеническом состоянии молока можно судить по загрязнению его механическими примесями, по количественному содержанию бактерий, характеру микрофлоры, кислотности, наличию возбудителей инфекционных заболеваний и т. д.

Для определения содержания микроорганизмов в молоке обычно применяют следующие прямые (метод посева на питательные среды; непосредственный подсчет микроорганизмов под микроскопом) и косвенные методы (редуктазная проба).

5.1.1 Определение общего количества бактерий в молоке
методом посева

Вначале готовят разведения (10-1– 10-6), для чего из отобранной пробы молока стерильной пипеткой берут 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (технику приготовления разведений см. в п. 2.1.1). Далее из разведений 10-4, 10-5 и 10-6 берут отдельной стерильной пипеткой по 1 мл суспензии, вносят в стерильные чашки Петри, а затем вносят 10 мл расплавленного и охлажденного до 50 ºС МПА. Суспензию с агаром перемешивают и чашки Петри с посевом помещают в термостат при температуре 30 ºС. После двухдневной инкубации подсчитывают колонии бактерий в чашках. Для подсчета общего количества бактерий в 1 мл общее количество колоний, выросших в бактериологической чашке, умножают на соответствующее разведение.

5.1.2 Подсчет микроорганизмов в мазках из молока методом
Брида

5.1.2.1 На предметном стекле восковым карандашом наносят квадрат площадью 2×2 см (400 мм²).

5.1.2.2 Микропипеткой в центр квадрата вносят 0,01 мл испытуемого молока и равномерно распределяют его в пределах квадрата, т. е. готовят мазок с известной площадью.

5.1.2.3 Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют и обезжиривают от 10 до 15 минут в спирт-эфире.

5.1.2.4 Мазок окрашивают 2...3 минуты водным 2%-ным раствором метиленовой синьки, промывают и высушивают фильтровальной бумагой.

5.1.2.5 Проводят расчет количества микробов, содержащихся в одном миллилитре испытуемого молока:

– определяют, сколько полей зрения придется на площадь мазка, учитывая, что площадь поля зрения иммерсионного объектива равна 0,02 мм². Для этого площадь мазка делят на площадь иммерсионного объектива 400 мм²: 0,02 мм² = 20000 полей зрения;

– определяют сколько микроорганизмов содержится в мазке, приготовленном из молока: среднее количество бактерий, содержащихся в одном поле зрения иммерсионного объектива, умножают на количество полей зрения, укладывающихся в мазке (20000 полей зрения);

– так как мазок приготовлен из 0,01 мл молока, то в 1 мл их содержится в 100 раз больше.

5.1.3 Определение количества микроорганизмов в молоке

косвенным методом

В молоке содержатся различные ферменты, в том числе редуктаза – анаэробная дегидрогеназа, катализирующая передачу водорода от окисляемого субстрата любому ненасыщенному соединению кроме кислорода воздуха. Редуктаза накапливается в молоке главным образом при размножении в нем микроорганизмов. Поэтому количество ее в молоке – показатель его бактериальной обсемененности. Обнаруживается редуктаза по обесцвечиванию красителей – метиленового синего или резазурина.

При редуктазной пробе с метиленовым синим добавляют реактив в молоко, отчего оно окрашивается в синий цвет. Редуктаза восстанавливает метиленовый синий, переводя его в бесцветную лейкоформу. Поэтому в присутствии редуктазы молоко, окрашенное метиленовым синим, обесцвечивается.

По скорости восстановления в молоке метиленового синего можно примерно определить численность бактерий и степень загрязнения молока. Однако строгой зависимости между числом бактерий в молоке и временем обесцвечивания в нем метиленового синего нет, так как каждый вид бактерий выделяет определенное, неодинаковое количество редуктазы.

Взятие пробы проводят после тщательного перемешивания молока. В чистую пробирку наливают 1 мл рабочего раствора метиленового синего и 20 мл исследуемого молока. Пробирку закрывают резиновой пробкой, перемешивают путем медленного переворачивания и ставят на водяную баню или термостат при 38-40 ºС. Изменения окраски в молоке учитывают через 20 мин, 2 ч и 5,5 ч. Проба на редуктазу считается законченной, когда наступает полное обесцвечивание молока.
В зависимости от времени обесцвечивания метиленового синего молоко разделяют на четыре класса (таблица 2).

Получить полный текст

Таблица 2 – Определение качества молока по времени его

обесцвечивания

Показатель

Время обесцвечивания, ч

Примерное количество бактерий, млн

2,0– 0,5

Качество молока

Очень плохое

5.2 Лабораторная работа № 2. Методы количественного учета дрожжей (6 часов)

Цель работы:

Сравнить разные методы количественного учета клеток дрожжей.

Задания:

1. Провести количественный учет клеток дрожжей по методу
Коха, содержащихся в суспензии, предоставленной для анализа.

2. Провести подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева.

3. Определить количество клеток дрожжей в суспензии, используя нефелометрический метод.

4. Оформить результаты в таблицы, сравнить количество клеток дрожжей в 1 мл, определенные различными методами. Построить калибровочную кривую по показаниям ФЭК.

Оборудование и материалы:

– стерильные пипетки на 2, 5, 10 мл;

– пробирки;

– весы аналитические;

– фотоэлектроколориметр;

– чашки Петри;

– восковые карандаши;

– стерильная водопроводная вода;

– счетная камера Горяева;

– шпатели;

– колбы емкостью 150...250 мл;

– стерильная глюкозо-пептонная среда (среда Сабуро);

– стерильное солодовое сусло;

– прессованные пекарские дрожжи.

5.2.1 Метод Коха

Расплавляют в кипящей водяной бане 20 мл ранее приготовленной стерильной глюкозо-пептонной среды (глюкоза – 40,0 г; пептон – 10,0 г; агар – 35,0 г; вода водопроводная 1000 мл). Среду стерилизуют при давлении 1,5 атм от 20 до 30 мин и разливают ее в три стерильные чашки Петри около пламени горелки. Когда среда застынет, делают высев из полученной от преподавателя культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae для определения числа живых клеток. С этой целью готовят разведения исходной культуры согласно п. 2.1.1. Производят посев только разведений 1:1000, 1:10000, 1:100000 путем нанесения каждый раз новой стерильной пипеткой по 0,1 мл суспензии (предварительно тщательно размешанной) на поверхность среды в чашках Петри. Посевной материал тщательно распределяют по поверхности агаризованной среды стерильными шпателями.

Чашки Петри, засеянные дрожжами, помещают в термостат при температуре 30 ºС на время от 3 до 5 суток. Чашки Петри инкубируют в термостате крышками вниз.

На следующем занятии подсчитывают число колоний S . с erevisiae в чашках Петри, и делают пересчет для определения общего числа живых клеток в 1 мл суспензии по формуле в п. 2.1.3.

Результаты работы оформляют в виде таблицы 3.

Таблица 3 – Количественный учет дрожжей по методу Коха

Разведение

Количество колоний, выросших на чашке Петри

Среднее число колоний

Количество микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии

повторность

5.2.2 Подсчет клеток в камере Горяева

Используя все разведения, полученные в предыдущем опыте, подсчитывают число клеток дрожжей, пользуясь счетной камерой Горяева. Клетки подсчитывают в пяти больших квадратах, пользуясь объективом с увеличением 40´. Количество клеток в 1 мл соответствующей суспензии рассчитывают по формуле из п. 1.2.1. Полученные результаты заносят в таблицу 4.

5.2.3 Нефелометрический метод

Плотность клеток S . с erevisiae в жидкой среде определяют нефелометрически (ФЭК), используя кювету с длиной оптического пути
0,5 см и зеленый светофильтр (λ= 540 нм). Результаты измерений оптической плотности каждой суспензии (контролем служит вода) записывают в таблицу 4. На основании данных таблицы 4 строят калибровочную кривую, откладывая на оси абсцисс количество клеток дрожжей, а на оси ординат оптическую плотность соответствующей суспензии. Калибровочную кривую строят для быстрого определения количества клеток определенного вида микроорганизмов по показаниям ФЭК.

Таблица 4 – Количество клеток дрожжей в суспензиях, установленное с помощью камеры Горяева, и соответствующие показания ФЭК

Разведе-ние

Количество клеток микроорганизмов в большом квадрате счетной камеры

Среднее число клеток в малом квадрате а

Количество клеток М , млн/мл

Показа-ния ФЭК

5.2.4 Определение количества клеток дрожжей высевом
в жидкие среды

Работу проводят согласно методики, описанной в п. 2.2. В качестве питательной среды для выращивания дрожжей используют солодовое (пивное) сусло. В каждую пробирку со средой вносят по 1 мл суспензии дрожжей различных разведений, закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 30 ºС на трое суток.

После инкубации регистрируют рост микроорганизмов и определяют вероятное количество клеток дрожжей в единице объема исходной суспензии (см. таблицу 1). Результаты оформляют в таблицу.

5.2.4.1 Приготовление солодового сусла

Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при температуре 35 ºС. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогреве), получая солод . Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Затем нагревают до температуры 50 ºС и поддерживают эту температуру в течение 30 мин, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. Далее, для лучшего выделения фермента амилазы температуру поднимают до 57 ºС и поддерживают ее на этом уровне до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с йодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов.

Получить полный текст

Полученное сусло отфильтровывают через вату или бумажный фильтр. Такое сусло содержит от 10 до 20 % сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6…8 % и стерилизуют 30 мин при температуре 115 ºС и давлении 0,5 атм.

микроорганизмов в смыве с поверхности предметов.
Санитарно-микробиологический контроль воздуха (6 часов)

Цель работы:

1. Освоить методы санитарно-бактериологического контроля технического оборудования и инвентаря микробиологической лаборатории.

2. Изучить седиментационный метод оценки санитарного состояния воздуха закрытых помещений.

Задания:

1. Приготовить смывы с поверхности посуды, оборудования и столов, пользуясь специальными трафаретами.

2. Сделать посевы на МПА для определения общего количества микроорганизмов.

3. Приготовить мазки из смывов, зафиксировать термическим методом и окрасить по Грамму. Промикроскопировать, зарисовать и сделать заключение.

4. Определить содержание микроорганизмов в воздухе лабораторных помещений методом седиментации.

5. Заполнить протокол бактериологического исследования и сделать общее заключение по результатам исследований.

Оборудование и материалы:

– стерильные чашки Петри;

– МПА в колбах;

– пробирки;

– стерильные марлевые салфетки;

– пипетки градуированные на 1 мл;

– спиртовки;

– трафареты металлические;

– предметные стекла;

– бактериологические петли;

– пинцеты;

– микроскопы биологические;

– стерильная водопроводная вода;

– наборы реактивов для окраски по Грамму.

5.3.1 Приготовление смывов

Смывы с поверхности оборудования и предметов делают с помощью трафаретов площадью 1 и 5 см² из нержавеющего металла. Перед взятием пробы трафарет смачивают спиртом, поджигают и накладывают на поверхность исследуемого объекта. Стерильной марлевой салфеткой (или тампоном), смоченной 2 мл стерильной воды, тщательно протирают поверхность, ограниченную трафаретом. Затем салфетку помещают в колбочку с 8 мл стерильной воды. Далее площадь протирают вторым сухим тампоном и опускают его в ту же колбочку. Тампоны взбалтывают в стерильной воде от 5 до 10 мин, чтобы отмыть попавшие на них микроорганизмы.

Смывы с поверхности предметов содержат 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10.

Для определения общего количества микробов из колбы берут
1 мл смывной воды и заливают МПА (расплавленным и охлажденным до температуры 45 ºС), перемешивают в бактериологической чашке и после застывания ставят в термостат при температуре 37 ºС на двое суток.

При бактериологическом исследовании смывов микробное число (общее количество микроорганизмов на единице поверхности предмета) определяют методом Коха и выражают его на единицу поверхности предмета (обычно на 1 см²). То есть, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение и переводят результат на 1 см² площади исследуемой поверхности. Полученные результаты заносят в протокол бактериологического исследования (таблица 5) и делают общее заключение.

Санитарное состояние поверхности считается отличным, если общее количество микроорганизмов на 1 см² составляет от 0 до 100, хорошим – от 100 до 1000, удовлетворительным – более 1000, плохим – более 10000.

Таблица 5 – Протокол бактериологического исследования

Исследуемый объект

Площадь, см²

Количество микроорганизмов

Заключение о санитарном состоянии

5.3.2 Микрофлора воздуха

Простым методом исследования микрофлоры воздуха является качественный метод оседания микробов на поверхность агара в чашках Петри. Этот метод не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха. Он почти не улавливает тонкодисперсные бактериальные и пылевые фракции. Однако пользуясь этим методом, можно контролировать чистоту воздуха помещений. В зависимости от предполагаемой загрязненности воздуха микробами чашки со средой экспонируют от 5 до 20 мин. Чем чище воздух, тем продолжительнее экспозиция. Если поставлена цель уловить определенную группу микробов, используют элективную агаровую среду и экспозицию увеличивают на 30 минут.

Чтобы обнаружить микробы, содержащиеся в воздухе данного помещения, производят посев на стерильную чашку Петри со стерильным застывшим МПА. Для этого чашку Петри открывают и ставят в исследуемом помещении в таком месте, в котором нет движения воздуха. Чашку оставляют открытой определенное время, затем закрывают, переворачивают вверх дном и ставят в термостат на 48 ч.

На площади в 100 см² за 5 мин осаждается примерно столько клеток, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м³). Для расчета микробного числа воздуха используют следующую формулу:

X =

где Х – количество микробов в 1 м³ воздуха;

а – количество колоний в чашке;

в – площадь чашки (πr²), см²;

Получить полный текст

t – время экспозиции, мин;

5 – время экспозиции, мин;

10 – объем воздуха, из которого происходит оседание микробов за 5 мин, л;

100 – площадь, на которую происходит оседание, см²;

1000 – объем воздуха, л.

Если в среднем на одной чашке с питательным агаром содержание микробов в 1 м³ менее 1500, то воздух считается чистым, если более 2500 – загрязненным.

6 КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. По каким показателям судят о росте микроорганизмов в питательных средах?

2. Какие методы определения количества клеток микроорганизмов существуют?

3. На чем основаны косвенные методы определения количества клеток микроорганизмов?

4. От чего зависит выбор метода определения количества клеток микроорганизмов?

5. Чем определяется точность любого метода и от чего зависят технические ошибки метода?

6. Какие методы определения количества клеток микроорганизмов под микроскопом вы знаете, в чем их основные ограничения использования?

7. В чем преимущества и сущность метода Виноградского -
Брида?

8. Какие ограничения имеет метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер?

9. Какое устройство имеет счетная камера Горяева и каковы правила работы с ней?

10. В чем состоит сущность метода микрокультур?

11. В каких случаях используют для подсчета клеток микроорганизмов мембранные фильтры, в чем состоят особенности работы с ними?

12. В чем состоит смысл принципа Коха и в основе какого метода определения количества клеток микроорганизмов он лежит?

13. Какие этапы выделяют в чашечном методе Коха?

14. Что такое КОЕ?

15. Основные правила приготовления разведений исходной суспензии.

16. Как проводят посев суспензий и подсчет выросших колоний при высеве на плотные питательные среды?

17. В чем состоит принцип метода определения количества клеток высевом в жидкие среды?

18. Что такое числовая характеристика и правила ее составления?

19. Привести пример расчета числа микроорганизмов в единице объема по таблице Мак - Креди.

20. В каких случаях применяют метод определения биомассы микроорганизмов взвешиванием и какие он имеет ограничения использования?

21. Из каких операций состоит метод определения биомассы взвешиванием?

22. На чем основывается нефелометрический метод определения количества клеток и биомассы микроорганизмов?

23. Микробиология молока и молочных продуктов.

24. Какие методы обычно применяют для определения общего количества микроорганизмов в молоке?

25. В чем сущность косвенного метода определения количества микроорганизмов в молоке?

26. Как правильно приготовить солодовое (пивное) сусло?

27. Как проводят приготовление смывов с поверхности оборудования и предметов для их санитарно-бактериологического контроля?

28. Как определяют микробное число при бактериологическом исследовании смывов?

29. В каком случае санитарное состояние поверхности считается отличным?

30. Микрофлора воздуха.

31. В чем особенности седиментационного метода оценки санитарного состояния воздуха закрытых помещений?

ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

1. Каждый студент в микробиологической лаборатории работает на постоянном месте, выполняя задания индивидуально.

2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов. Личные вещи следует хранить в специально отведенном месте.

3. Студент должен работать только в чистом халате, сменной обуви, волосы должны быть подобраны, не падать на плечи.

4. В лаборатории запрещается курение, прием пищи, лишнее хождение по лаборатории.

5. Нельзя оставлять работающие лабораторные установки, а также включенные приборы без присмотра.

6. При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать все правила микробиологической техники: на пробирках, колбах, чашках Петри, должна быть сделана надпись, содержащая родовые и видовые названия культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.

7. Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами , не допускать их распыления – не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

8. Перед тем как набирать ртом с помощью пипетки суспензии микроорганизмов или реактивы, следует убедиться, что пипетка закрыта с тупого конца ватой.

9. Ни в коем случае нельзя дуть на загоревшуюся пробку, так как это только усилит горение, ее нужно быстро ввести в пробирку, где вата сама потухнет.

10. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружением в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).

11. Все засеянные пробирки, чашки помещаются в термостат или сдаются лаборанту; отработанный материал (пробирки, чашки Петри) также помещается в определенные емкости по указанию лаборанта для их дальнейшего обеззараживания.

12. В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее место, тщательно вымыть руки; необходимо иметь индивидуальное полотенце, салфетки для вытирания рук.

13. Перед уходом из лаборатории дежурный должен проверить, выключены ли газ, вода, электроприборы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Асонов, по микробиологии / . – М.: Агропромиздат, 1988. – 155 с.

2. Борисов, к лабораторным занятиям по микробиологии / [и др.]. – М.: Медицина, 1984. – 256 с.

3. Градова, практикум по общей микробиологии / [и др.]. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 131 с.

4. Лерина, работы по микробиологии / , . – М.: Экономика, 1986. – 158 с.

5. Нетрусов, по микробиологии / [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

6. Теппер, по микробиологии / , . – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.

7. Трушина, гигиена и санитария в торговле / . – Ростов н/Д: Феникс, 2000. – 320 с.

ВВЕДЕНИЕ_____________________________________________

1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД МИКРОСКОПОМ______________

1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках

(метод Виноградского – Брида)_____________________________

1.2 Подсчет клеток в счетных камерах______________________

1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах________________

1.4 Метод микрокультур_________________________________

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ____________________

2.1 Определение количества клеток высевом на плотные

питательные среды (метод Коха)____________________________

2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды

(метод предельных разведений)_____________________________

3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ__________

3.1 Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров
до постоянного значения__________________________________

3.2 Отделение микроорганизмов от среды___________________

3.3 Определение биомассы_______________________________

4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ

НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ______________________

5 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ________________________________

5.1 Лабораторная работа № 1. Методы определения общего

количества микроорганизмов в сыром молоке (6 часов)________

5.2 Лабораторная работа № 2. Методы количественного учета

дрожжей (6 часов)________________________________________

5.3 Лабораторная работа № 3. Определение количества

микроорганизмов в смыве с поверхности предметов.
Санитарно-микробиологический контроль воздуха (6 часов)____

6 КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ_____________________________

7 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ

ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ_________________________________

ЛИТЕРАТУРА___________________________________________

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ

по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология»,

«Общая биология и микробиология» для студентов
специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» всех форм обучения

Редактор

Подписано в печать 17.03.2007. Формат 60´84 1/16

Усл. п. л. - 2,09. Уч.-изд. л. - 2,25

Печать - ризография, множительно-копировальный
аппарат «RISO TR-1510»

Тираж 50 экз. Заказ 2007-11

Издательство Алтайского государственного

технического университета

Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ

Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ

Сущность метода

Метод прямого счета микробных клеток в счетных камерах – один из наиболее быстрых и достаточно точных. Данный метод успешно применяется для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях. Однако счетные камеры Горяева, Нажотта могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей грибов, микроскопируемых при увеличении микроскопа (окуляр 10–15´, объектив 8–40´).

Устройство и подготовка камеры Горяева

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло с прямоугольным углублением в центре. Глубина камеры составляет 0,1+0,005 мм. На дне углубления нанесена сетка из 400 квадратов. Сторона сетки соответствует 3+0,005 мм, площадь одного малого квадрата соответствует 1/400 мм2, большого – 1/25 мм2.

Каплю с микроорганизмами помещают в центр камеры и накрывают специальным покровным стеклом, тщательно притирая его по краям камеры до появления ньютоновских колец. При этом толщина слоя жидкости в камере над сеткой соответствует 0,1 мм, а объем камеры 0,9 мм3 (около 1мм3). Каждый малый квадрат ограничивает объем жидкости в 1/4000 мм3 , или 1/4000000 мл (1 мл = 1000 мм3).

Подсчет клеток в камере начинают через 3...5 мин. после заполнения ее, когда клетки осели и расположились в одной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали. Количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10.

Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600, поэтому из исследуемой взвеси микроорганизмов берут 3 – 4 пробы для монтажа камеры.

Материалы и оборудование

– счетная камера Горяева;

– водоструйный насос;

– мембранные фильтры № 5,6;

– колба на 500мл с пробой природной воды;

– склянка на 20мл из-под пенициллина;

– пипетка глазная;

– микроскоп;

– кисточка колонковая;

– формалин 40%.

Проведение анализа

Пробу природной воды содержащей водоросли, объемом 500 мл, сгущают с помощью водоструйного насоса на мембранном фильтре. В конце фильтрования необходимо следить, чтобы над фильтром остался тонкий слой воды. Затем сгущеный осадок с фильтра осторожно переносят в склянку при помощи кисточки и доводят до объема 5мл дистиллированной водой. Консервируют препарат формалином или раствором Люголя.

После тщательного взбалтывания, каплю взвеси с водорослями из склянки наносят в центр счетной камеры пипеткой. Счетную камеру накрывают покровным стеклом, тщательно притирая его с краев до образования ньютоновских колец (цветных полос).

Подсчет клеток в камере начинают через три – пять минут после ее заполнения, когда клетки осели и расположились водной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали.

Для статистической достоверности в каждой пробе необходимо определить и просчитать все виды не менее трех раз с последующим вычислением среднего арифметического. Пересчет общей численности производится по формуле

где N – число клеток в 1 мл воды, n – число клеток в камере объемом 1мм3;
v 1 – объем концентрата пробы (5 мл);
v 2 – объем камеры в мл (0,001);
w – объем профильтрованной воды (500 мл);

Отчет по работе должен содержать:

– расчет общей численности водорослей;

– расчет численности доминирующих видов;

– рисунки часто встречающихся видов.

* Тимолфталеин используют при титровании очень слабых кислот и катионов очень слабых оснований

* Если анализируют сточную воду, ее разбавляют стерильной водой в несколько раз.

** Вся применяемая посуда должна быть стерильной.

* Фильтровальный аппарат стерилизуют кипячением в течение 30-40 мни, а ультрафильтры-в течение 10 мин.

Дрожжи.
Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей ; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева.

Задания:

1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae и аспорогннных дрожжей;

2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей;

3) определить содержание гликогена и метахроматина в дрожжевых клетках;

Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8 Х и 40 Х.

Оборудование и материалы: предмет­ные и покровные стекла ; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см 3), раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1: 40, бензин, набор красок, раствор йода , иммерсион­ное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candi­da, Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces.
Теоретические сведения.
По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточ­ные микроскопические организмы , относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15 мкм. Они встречаются среди различных классов высших гри­бов: аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных гри­бов. Растут дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую , апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33).

Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий, включает оболочку, цитоплазму, диф­ференцированное ядро и другие фрагменты. Оболочка дрож­жей легко просматривается в обычном световом микро­скопе. Содержимое клеток дрожжей на ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появля­ются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуо­лей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры: в молодых клетках дрожжей вакуо­ли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате нарушения взаимодейст­вия коллоидов внутри клетки.

В клетках дрожжей накапливается большое количест­во запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира , а в вакуолях-волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифос­фаты.

Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При почковании на по­верхности клетки образуется один или несколько бугор­ков - почек, которые постепенно увеличиваются. Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки, после чего происходит деление ядер. В почку из мате­ринской клетки переходит часть протоплазмы и элемен­ты ядра, после чего между двумя клетками образуется поперечная перегородка и почка отшнуровывается. Иног­да почки, еще не отделившиеся, начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток (рис. 35).

При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного размножения путем почкования. Обычно спорообразование наблюдается при истощении питатель­ной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выра­щивать в постоянно обновляемой среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только почко­ванием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду , бедную питательными субстратами, как большинство кле­ток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рас­сматривается как аск (сумка), а споры - как аскоспоры.

К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты).

Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в ме­ньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, обра­зование спор у дрожжей - это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых форм.

Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования од­ной или нескольких поперечных перегородок. Такой спо­соб размножения наблюда­ется, например, у представи­телей рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно , поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces.

Дрожжи способны раз­лагать различные сахара. Поэтому они встречаются там, где происходит выделе­ние богатых сахаром соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для производства кефира.

В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces ce­revisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности.

S – площадь квадрата сетки, мм 2 ;

n – степень разведения исходной суспензии;

1000 мм 3 = 1 мл.

Контрольные вопросы.

1. 
   К каким группам грибов относятся дрожжи?
2. 
   Назовите физиологические признаки дрожжей. Где используются дрожжи?
3. 
   Опишите форму клеток дрожжей и способы их размножения.
4. 
   Дайте характеристику аспорогенных дрожжей.
5. 
   Какие включения клеток дрожжей Вы знаете?
6. 
   Как обнаруживается волютин в дрожжах?
7. 
   Как определить способность дрожжей к размножению?
8. 
   Как обнаружить гликоген в клетках дрожжей?
9. 
   Каким методом можно определить количество дрожжей в 1мм суспензии?