Иммунная реакция. Типы иммунных реакций Какие иммунологические реакции есть

Иммунологические методы исследования – диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для:

Определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов,

Видовой принадлежности белка,

Распознавания аллергии и аутоиммунных болезней,

Беременности,

Гормональных нарушений, а также

В научно-исследовательской работе.

Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе И. м. и. изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек - носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.

Иммунодиагностика

Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.

Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.

Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.

Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.

Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.

К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.

Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

протекающие in vivo . воспроизводимые in vitro

(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)

гуморальные клеточные серологические клеточные

В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).

Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .

Таблица № 15.

Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro

Феномены иммунодиагностических реакций
Агглютинации	Потребления комплемента	Иммунофлюо-ресценции	Преципитации	Нейтрализации	Иммуноконъю- гации
группы иммунодиагностических реакций
а. прямые б. непрямые в.торможения г. сорбции	б. непрямые в. торможения	б.непрямые в.торможения	а. осадочные б. диффузионные	а. гашения действия б.нейтрализа-ции	а. прямые б.непрямые в. торможение

Иммунологические феномены

Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.

К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.

К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.

К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.

К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).

Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента

К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).

К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).

К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).

К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).

Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.

К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.

К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).

К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.

Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.

Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.

Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.

По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.

К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.

К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.

В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).

Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

Исследуемая культура.

Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА .

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновые антительные антигенные

белковые небелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап . Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап . Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
Исследуемая сыворотка, 1:50
Растворитель
Полученные разведения
АЭД, 5 % взвесь
Результат РНГА
Титр РНГА	Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли: первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап . Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап . Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап . Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
Известная сыворотка 1:100
Растворитель
Полученные разведения
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки	Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600): 3 = 1:533 .

В основу реакций иммунитета положено специфическое взаимодействие антигена с антителом. С помощью известных антигенов можно определить наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого лица (серологическая диагностика инфекционных заболеваний). И, наоборот, наличие специфических иммунных сывороток позволяет установить родовую, видовую и типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Агглютинация – склеивание микробов или других клеток при воздействии на них иммунной сыворотки, содержащей антитела – агглютинины. Реакция агглютинации проявляется в том, что равномерной взвеси клеток, например бактерий, при добавлении иммунной сыворотки происходит скручивание клеток, образование зернышек или хлопьев, которые постепенно оседают на дно, жидкость же над осадком совершенно просветляется. Однако зернышки или хлопья образуются только в том случае, если реакция происходит в присутствии электролитов. Таким образом, для проявления реакции агглютинации нужно иметь: 1) антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток; 2)антитела (агглютинины) в виде иммунной сыворотки; 3) электролиты (физиологический раствор).

Внешнее проявление положительной реакции агглютинации бактерий имеет двоякий характер в зависимости от свойств антигена: у безжгутиковых бактерий, имеющих только один соматический или О-антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток, и образующиеся кучки имеют вид мелких компактных зерен. Такая агглютинация называется тонкозернистой; она происходит медленно – в течение 18-22 часов. У бактерий со жгутиками имеются два антигена – соматический, О-антиген, в самой клетке и жгутиковый, Н-антиген, находящийся в жгутиках. Клетки склеиваются друг с другом жгутиками и образуют рыхлые крупные хлопья. Такая агглютинация называется крупнохлопчатой; она наступает быстро – в течение 2-4 часов.

Реакция аггютнации благодаря своей специфичности, простоте и постановке и демонстративности получила широкое распространение в микробиологической практике для диагноза многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа, сыпного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, бруцеллеза и др. Ею пользуются с диагностической целью в 2 направлений.

1. Для определения выделения выделенного из какого-либо субстрата неизвестного микроба. В этом случае агглютинацию ставят с определенной, заранее приготовленной агглютинирующей сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов определенным видом бактерий и, следовательно, содержащей агглютинины в отношении этих бактерий.

В качестве антигена берут культуру неизвестного исследуемого микроба. Положительный результат реакции указывает, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления агглютинирующей сыворотки.

2. Для обнаружения агглютининов к тому или другому определенному виду бактерий в сыворотке больного. В этом случае для агглютинации берут определенную лабораторную культуру бактерий (или несколько культур бактерий разных видов) в качестве в качестве антигена и сыворотку больного. Положительный результат агглютинации указывает на то, что сыворотке больного имеются агглютинины к определенному, известному, виду микроба, т.е. данный микроб является возбудителем заболевания, в процессе которого в сыворотке больного накопились защитные антитела.

Механизм: «теория решетки».

Активный центр АТ соединяется с 1 антигенной детерминантой, 2-ой активный центр реагирует с антигенной детерминантой, находящейся на 2 молекуле АГ, в результате происходит склеивание. Если в качестве АТ взята безжгутиковая бактерия, то зернистость мелкая – агглютинация., если жгутиковая – Н-агглютинация (крупная зернистость).

Варианты агглютинации:

1. Ориентировочная на стекле – для выявления серологических свойств бактерий, для выявления признаков, для идентификации.

2. Развернутая в пробирках – мало чувствительна и невысоко специфична. Определяется титр АТ (это максимальное разведение сыворотки, в которой обнаружена агглютинация).

3. РНГА (нагрузочная реакция) – реакция непрерывной Геной агглютинации – используется АГ, абсорбированный на эритроцитах барана, т.о. перевод из растворимого в корпускулярный – агглютинация эритроцитов.

Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовится путем иммунизации кроликов.

Сыворотка от больного для постановки реакции агглютинации получается из его крови, взятой стерильно на локтевой вене в количестве 5-10 мл. одновременно часть крови употребляется для посева. Если же кровь нужна только для постановки реакции, вполне достаточно 1-2 мл. тогда берут кровь из пальца проколом иглой Франка.

АГ для реакции агглютинации являются соответствующие живые ил убитые культуры бактерий. Живыми культурами пользуются тогда, когда агглютинация ставится с целью определения вида бактерий, выделенных из какого-либо субстрата.

Диагностикумы – диагностические препараты, содержащие АГ и используемые для обнаружения АТ.

24 Реакция преципитации и ее значение, область применения. Методы постановки. Преципитирующие сыворотки, их получение и титрование. Использование реакции преципитации в диагностике инфекций.

Реакции преципитации основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии АГ с АТ. РП позволяют выявлять незначительные количества АГ. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси с АГ. Метод имеет много разновидностей.

Реакция кольцепиципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую АГ, и чрез несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата.

Реакции микропреципитации применяют для нефелометрического выявления АТ в небольших образцах сыворотки.

Преципитация в геле – на агаре с ее помощью определяют токсигенность выделенных бактерий. При дифтерии, стаф.токсикозе, для определения клеточного иммуноглобулина в сыворотке крови.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить минималейшие следы белка – антигена (до разведения 1:100000 и выше), благодаря чему преципитация практически стала важной реакцией в химии, биологии и т.д.

Чрезвычайно большое значение реакция преципитации имеет в судебномедицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови не только в свежем и жидком состояниях, но также и в высушенном, например, в пятнах очень давнего происхождения на одежде.

В санитарной практике реакция преципитации является методом для определения фальсификации мясных, мучных и других препаратов.

Для серологического диагноза пользуются реакцией преципитации в тех случаях, когда АГ может быть получен только в жидком состоянии, например в вытяжке из инфицированных органов, в спинномозговой жидкости, в моче больного и т.д.

Реакции преципитации можно ставить как с веществами белковой природы – полноценными АГ, так и гаптенами – неполноценными АГ, которые сами по себе не могут вызывать образование АТ, но могут вступать в соединение с ними.

Постановка реакции. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

1. преципитирующую сыворотку, приготовленную путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном;

2. исследуемый АГ в виде отцентрифугированного или профильтрованного прозрачного раствора (экстракт их микробных тел, патологических субстратов от больного, органов, кровяных пятен, сывороточные белки и т.д.) Перед постановкой реакции разводят АГ – физиологическим раствором не менее чем на 1:1000;

3. физиологический раствор (для разведения сыворотки и АГ);

4. специальные узкие (не шире 0,75 см) пробирки с конусообразным дном и очень прозрачного стекла;

5. пастеровские пипетки;

Обязательным условием является полная прозрачность участвующих в реакции агглютинации ингредиентов – сыворотки и АГ. В противном случае результаты реакции будут не ясны.

В пробирку наливают 0,2 мл преципитирующей сыворотки; затем при помощи пастеровской пипетки осторожно наслаивают на сыворотку 0,2 мл АГ (спускают жидкость по стенке пробирки так, чтобы она не смешивалась с сывороткой, а образовала над ней верхний слой). Добавив АГ. Пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции сразу же или в течение 5-10 минут на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо от выпавшего в осадок АГ. Степень реакции оценивается по величине кольца и времени его проявления.

К опыту ставится несколько контролей, а именно: 1) заведомо известны АГ + специфическая преципитирующая сыворотка; 2) преципитирующая сыворотка + физиологический раствор; 3) нормальная сыворотка + исследуемый АГ.

25 Реакция иммунного лизиса как один из механизмом иммунитета. Компоненты реакции, практическое использование.

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки при инфекции является ее способность растворять (лизировать) м/о или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят названия лизинов. В зависимости от АГ они точнее называются бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами и т.д.

Лизины способны проявлять свое лизирующее действие на АГ только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент является составной частью любой свежей сыворотки, как нормальной, так и иммунной. При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается.

Т.о. реакция лизиса происходит при участии двух компонентов: одного специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (АТ), и другого неспецифического, присущего любой сыворотке, как иммунной, так и нормальной (комплемент).

Свежеизвлеченная из организма иммунная сыворотка способна к лизису, так как содержит и АТ и комплемент. Если же пользуются иммунной сывороткой, стоявшей или подвергнутой подогреванию и вследствие этого утратившей комплемент, то лизис произойдет только при условии добавления комплемента, т.е. свежей сыворотки. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее инактивируют нагреванием при 56 градусов в течение 30 минут (для разрушения имеющегося в ней комплемента) и прибавляют к ней строго определенное количество комплемента. В качестве комплемента принято пользоваться свежей сывороткой нормальной морской свинки.

При дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.

26. Реакция связывания комплемента в диагностике инфекционных заболеваний. Практическое применение, компоненты реакции.

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения АГ в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, так и растворимых Г. Последнее связано с тем, что комплемент связывается с Fc- фрагментом АТ независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом АГ-АТ за счет Fc-фрагментов последнего и на вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия.

Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплиментарность.

Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при температуре 37 градусов в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Т.о в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой АГ-АТ, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой АГ-АТ, т.е на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкратной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++

27 Неполные антитела. Реакция Кумбса (прямая и непрямая). Обнаружение антител к резус фактору у беременных женщин.

Неполные АТ – АТ, имеющие только один активный центр – являются одновалентными.

Реакция Кумбса.

Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллезе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) АТ.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

Иммунофлюоресценция

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель, дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –

отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании

препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и

наличие и титр специфических антител. Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой

иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.

29. Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины, вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов, для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,

поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН in vivo может быть использована для определения степени напряженности антитоксического иммунитета в организме человека (проба Шика).

Токсин – яд микробного происхождения. Токсины микробов делятся на эндотоксины и экзотоксины. Характеристика токсинов см. тема №6.

Анатоксин – обезвреженный токсин. Получают из экзотоксинов путем их обработки формалином и теплом. Анатоксин не обладает ядовитостью, при этом сохраняет антигенные и иммуногенные свойства токсина. Сила

действия анатоксина измеряется в ИЕ. ИЕ (иммуногенная единица) – это такое количество анатоксина, которое в смеси с 1 АЕ сыворотки дает инициальную флоккуляцию. Титр анатоксина – количество ИЕ в 1 мл.

Анатоксины титруют в реакции флоккуляции. Анатоксин используется в качестве вакцины для создания активного антитоксического иммунитета. Примером таких вакцин являются дифтерийный анатоксин, столбнячный

анатоксин и др. Анатоксин используется также дл получения антитоксических сывороток.

Антитоксин или антитоксическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к токсину. Антитоксические сыворотки – это гетерологичные сыворотки, их получают путем гипериммунизации лошадей соответствующими анатоксинами с последующим взятием у животных крови и получения сыворотки. Содержание антитоксина в антитоксических сыворотках выражается в международных единицах (ME), принятых ВОЗ. Например, 1 ME противостолбнячной сыворотки соответствует ее

минимальному количеству, нейтрализующему 1000 минимальных смертельных доз (DLm) столбнячного токсина для морской свинки массой 350 г. 1 ME противоботулинического антитоксина - наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее 10000 DLm ботулинического токсина для мышей массой 20 г. 1 ME противодифтерийной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 100 DLm дифтерийного токси-на для морской свинки массой 250 г.

30. Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм РФ сходен с таковым реакции преципитации. В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки

31. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод являетсянеконкурентным . Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным .

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

1. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антигенконкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные типы тест-систем (диагностических наборов) в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

1. Лизатные - в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

2. Рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

3. Пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Теории иммунитета

1) Эрлиха теория иммунитета (теория боковых цепей) - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена.

2) Клонально-селективная теория , теория Бернета - теория, согласно которой в организме возникают клоны клеток, иммунокомпетентных в отношении различных антигенов; антиген избирательно контактирует с соответствующим клоном, стимулируя выработку им антител.

1. Антитела и лимфоциты с необходимой специфичностью уже существуют в организме до первого контакта с антигеном.

2. Лимфоциты, участвующие в иммунном ответе, имеют антигенспецифичные рецепторы на поверхности своих мембран. В случае B-лимфоцитов рецепторами являются молекулы той же специфичности, что и антитела, которые эти лимфоциты впоследствии продуцируют и выделяют.

3. Каждый лимфоцит несет на своей поверхности рецепторы только одной специфичности.

Лимфоцит, сенсибилизированный антигеном, проходит несколько стадий пролиферации и формирует клон плазматических клеток. Плазматические клетки синтезируют антитела только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцит-предшественник. Сигналами к пролиферации служат связывание антигена и цитокины, выделяемые другими клетками (в первую очередь, Т-хелперами. Сами активированные В-лимфоциты также выделяют цитокины.

3) Селективную теорию образования антител сформулировал Ерне, он предположил, что в организме синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде естественных антител. Функция их состоит в том, чтобы избирательно связываться с соответствующим антигеном и таким способом доставлять его неким клеткам организма, для которых они служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, т.е. к образованию антител. Это была первая теория, которая объясняла также феномен иммунологической толерантности, принимая, что любые естественные антитела направленные против собственных антигенов будут немедленно абсорбироваться тканями организма, и таким образом не могут запустить образование аутоантител.

34. Иммунологи́ческая толера́нтность - способность иммунной системы специфически не реагировать на конкретный антиген. Например, при беременности развиваетсятолерантность иммунной системы матери

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ , основаны на взаимодействии антигена и находящегося в иммунной сыворотке антитела (согласно представлениям Эрлиха) или антигена и специфически измененной под влиянием иммунизаторного раздражения сыворотки (согласно новейшим воззрениям). Важнейшие И. реакции-аглютинация, преципитация, бактериолиз, реакция отклонения комплемента, реакция, основанная на действии опсонинов. Аглютинация и преципитация происходят при встрече антигена и соответствующего антитела; для осуществления бактериолиза, реакции отклонения комплемента и др. требуется помимо антигена и антитела также участие комплемента. Значение И. реакций двоякое. С их помощью можно ставить диагноз той или иной заразной болезни, приводя в соприкосновение сыворотку больного с микробом, возбудителем предполагаемой инфекции (реакция Видаля при брюшном тифе и парати-фах, реакция отклонения комплемента при различных инфекциях). С другой стороны, имея сыворотку, иммунную к определенной инфекции, возможно идентифицировать микроб, природа к-рого неизвестна. Преципитация имеет значение также в сан.-гиг. и суд.-мед. практике, позволяя определять видовую принадлежность животного, к которому относится исследуемый материал.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);
- концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
РЕАКЦИИ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ФГБОУ
ВО ТГМУ 2016Г

план

ПЛАН
1. Серологические реакции, которые используются
для серологической диагностики.
2.Серологические реакции, которые используются
для серологической идентификации.
3.Современные методы Иммунологических
исследований при инфекционных болезнях:
(Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный
анализ, генодиагностика,
полимеразная цепная реакция).
4.Серологические реакции, которые используются в
вирусологии.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

ВСЕ СЕРОЛОГИЧНЫЕ
РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ
С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ:
для выявления антител в сыворотке больного
с помощью стандартных антигеновдиагностикумов – для серологической
диагностики инфекционной болезни;
для определения неизвестных антигенов
(бактерий, грибов, вирусов) за известными
стандартными сыворотками-антителами –
для серологической идентификации
возбудителей.

классифиация

КЛАССИФИАЦИЯ
Иммунные реакции подразделяются на простые и
сложные. Для их постановки необходимы
основные два компонента: антиген и антитело.
К простым реакциям, применяемым для
диагностики, относятся реакции агглютинации,
реакции преципитации, реакции нейтрализации.
К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный
метод, радиоиммунный метод,
иммуноферментный метод,
иммунолюминесцентный метод исследования,
метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание)
внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок
корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а
также частиц с адсорбированными на них антигенами под
влиянием антител в среде с электролитом.
Реакция протекает в две фазы.
В первой фазе происходит специфическая адсорбция
антител на поверхности клетки или частицы, несущей
соответствующие антигены,
Во второй - образование агрегата (агглютината) и
выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит
только в присутствии электролита (раствор хлорида
натрия).

Агглютинат

АГГЛЮТИНАТ
Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и
крупнохлопчатый.
Мелкозернистый – это результат
взаимодействия мелких бактерий,
крупнохлопчатый – бактерий,
имеющих жгутики.

Реакция агглютинации-типы

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ-ТИПЫ
Все реакции агглютинации
подразделяются на два типа:
ориентировочные (ОРА), которые
выполняются на стекле,
развернутые (РРА) – выполняются в
пробирках с титрованием сыворотки.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И
ЧУВСТВИТЕЛЬНА.
Повысить специфичность и чувствительность
реакции можно путем разведения исследуемой
сыворотки до ее титра или половины титра.
Титром сыворотки называется то ее максимальное
разведение, в котором обнаруживается
агглютинация антигена.
Чем выше титр антител, тем достовернее
результаты реакции.
Чтобы дифференцировать причину
положительной реакции (ранее перенесенная
инфекция, вакцинация или текущее заболевание),
оценивают динамику нарастания титра
антител, которое наблюдается только при
текущей инфекции..

Основные цели

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ
Ориентировочные реакции также могут
иметь две цели:
Идентификация микробного вида (с
использованием известной иммунной
сыворотки).
Поиск антител в сыворотке крови
пациента с использованием известного
микробного диагностикума.

10. Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ

11. ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРА - ориентировочной реакции агглютинации

12. Схема ориентировочной реакции агглютинации.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ
АГГЛЮТИНАЦИИ.
Этапы выполнения реакции:
На обезжиренное стекло нанести
каплю физиологического раствора.
Внести петлей исследуемую культуру
бактерий, равномерно распределить в
капле физиологического раствора
Добавить каплю специфической
агглютинирующей иммунной
сыворотки
Учесть результат реакции.
Положительной считается реакция,
когда в капле происходит
просветление жидкости и
формирование агглютината.

13. ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

++++
Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление
жидкости. Результат положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над
осадком слегка мутновата. Результат положительный
++
Слабая
агглютинация:
осадок
небольшой,
жидкость
непрозрачная.
маленький,
надосадочная
Результат слабоположительный
+
Следы
агглютинации:
осадок
непрозрачная. Сомнительный результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.
жидкость

14. модификации Реакция агглютинации: это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ
МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА.
Реакция Минкевича позволяет определить наличие
противотуляремийных антител у инфицированного
пациента.
Необходимые ингредиенты:
Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора
из пальца больного
Дистиллированная вода
Туляремийный диагностикум.

15. Этапы выполнения реакции Минкевича:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА:
На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента
Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов
Внести каплю туляремийного диагностикума
Учесть результаты.
Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна
агглютината.

16. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить
антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента,
но и определить титр антител.
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка пациента
Физиологический раствор
Бруцеллезный диагностикум

17. Принцип метода

ПРИНЦИП МЕТОДА
основан на использовании большого стекла фотопластины,
концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в
нарастающих или уменьшающихся объёмах,
дополняемой до определённого уровня физиологическим
раствором, что приравнивается к разным разведениям, и
окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей
видимости образующегося агглютината.
Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём
лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при
+37Сº.
На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от
нескольких больных.
Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината
разной активности в зависимости от разведений.

18. реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их сер

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ
ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА
:
Данная реакция основана на способности
родственных групп бактерий адсорбировать из
антисыворотки только групповые антитела при
сохранении в ней типоспецифических антител.
Полученные сыворотки называются монорецепторным,
так как содержат антитела только к одному
определенному антигену.
При наличии у разных бактерий одинаковых или
сходных групповых антигенов они могут
агглютинироваться одной и той же антисывороткой,
что затрудняет их идентификацию.

19.

Принцип метода:
Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител
методом адсорбции
специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и
специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ -
только групповые.
В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют
родственные гетерологические АГ.
Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала
агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым
паратифа А.
Диагностикум с
антигенами
брюшного тифа
(АВСД)
Исследуемая
сыворотка с
антителами
(abcd)
2 часа +37C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
abcd
ABC
D
AT
АГ
2 часа +37 C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
ABCD
ABEF
ABCD
ABEF

20. Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ)
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И
АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ)
Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы
полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в
присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена
или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно
быстро – на протяжении 2-7 мин.
Нагруженные антителами частицы латекса широко
используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.
Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в
сыворотке больного.
Такую модификацию РАЛ используют для выявления
противогриппозных, противокраснушных,
протикоревых антител и т.д.

21. Проведение реакции латекс-аглютинации

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
ЛАТЕКС-АГЛЮТИНАЦИИ

22. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм
Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится
белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG
человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на
стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в
окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых
находится активный центр антитела.

23. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая
одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого
материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и
др.) и стафилококкового диагностикума.
Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на
тёмном фоне должна четко будет просматриваться
мелкозернистая агглютинация стафилококков.

24. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ)
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Основана на способности антител взаимодействовать с
антигеном, фиксированным на различных
эритроцитах, которые при этом агглютинируют.
Для постановки этой реакции необходимо приготовление
эритроцитарного диагностикума.
Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов:
антигенный и антительный.

25. Этапы выполнения реакции:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ:
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка крови
инфицированного
пациента
В лунки планшета внести физиологический
раствор в одинаковом количестве -0,25 мл
для разведения сыворотки
В первую лунку внести сыворотку крови
пациента, разведенную в 50 раз в объеме
0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой
и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и
перенести в следующую лунку
Перемешать содержимое и повторить эту
процедуру во всех лунках, предназначенных
для проведения реакции.
Приготовить контроль, для чего в одну
лунку внести 0,25 мл физиологического
раствора
Во все лунки, включая контрольную,
внести по 2 капли приготовленного
эритроцитарного диагностикума и
перемешать путем осторожного
покачивания планшета.
Физиологический раствор
Эритроцитарный
диагностикум
Реакция пассивной
гемагглютинации
выполняется в лунках
иммунологического
планшета.

26. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на
дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в
опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика».
Схема постановки и учета РПГА

27. Критерии учета результатов реакции

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
++++
Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат
положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна
лунки. Результат положительный
++
Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна
лунки. Результат сомнительный
+
Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный
результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадок занимает центральное
положение с округлыми краями.

28. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ.

.
РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Развернутые реакции агглютинации предложены для
поиска антител в сыворотках крови инфицированных
пациентов при некоторых бактериальных инфекциях.
При этом применяются диагностикумы,
приготовленные из микроорганизмов.
Для выполнения этих реакций необходимо
предварительное титрование сыворотки.

29. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ.
Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора
1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или
1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора
1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или
1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора.
В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора.
8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль
сыворотки и контроль антигена.
В контроль сыворотки вносим только разведенную
сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только
взвесь диагностикума.

30. Учет реакции

УЧЕТ РЕАКЦИИ
Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси
диагностикума.
В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках
просветляется, на дно оседает осадок агглютината.
Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки
должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно
мутная взвесь диагностикума.
Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно
видно формирование осадка агглютината.

31. СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты
Содержимое пробирок
Физиологический
раствор
0,85
Контроль
Сыворотки
Антигена
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
в 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
--
%
хлорида натрия, мл
Сыворотка
разведении 1:50 мл
Разведения
Диагностикум,
млрд.
(1: 50)
1: 100
1-2 2к
1: 200
1: 400
1: 800
-
2к
2к
2к
-
микробных В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при
тел в 1 мл.
комнатной температуре
2к

32. Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ
АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ:
В реакции агглютинации они корпускулярные, даже
целые клетки, а в реакции преципитации –
молекулярные, в растворимом состоянии.
Антигенами могут быть экстракты
микроорганизмов, тканей, органов, химические
вещества.
Феномен преципитации заключается в том, что
антитела (преципитины), соединяясь с
растворимыми антигенами (преципитиногенами),
предопределяют образование осадка (преципитата)
или помутнения раствора.
За титр реакции принимают наибольшее разведение
антигена, которое дает положительный результат.

33. Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО
ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРАКТИКЕ:
В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения
видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду
принадлежит выявленная кровь.
Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для
диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы,
дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской
язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех,
щетина).
Реакцию Ухтерлони используют для определения
антигенного состава органов и тканей, как нормальных,
так и опухолевых, количества антигенов в сложных
системах.
Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других
заболеваний.

34. . Выявление АГ в реакции кольцепреципитации.

. ВЫЯВЛЕНИЕ АГ В РЕАКЦИИ
КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ.

35. Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС).
Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых
обследованиях на сифилис.
В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов,
антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический).
Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета.
Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов
применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген
(контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная
сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата).
В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении
1:10 и кардиолипиновый антиген.
После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем
планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в
лунке становится прозрачной.
Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат,
оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4
++++ - положительным. Схема реакции микропреципитации
представлена на рис. 10.

36. Экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА
СИФИЛИСА (ЭДС).

37. Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ)
Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии
антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена
образуют линии и полосы преципитации.
Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной
диффузии, можно проводить количественное определение
антигенов.
Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и
встречной иммунодиффузии позволяет оценивать
иммунохимическое сходство или различие антигенных
компонентов.
Методы иммунодиффузии характеризуются высокой
специфичностью и чувствительностью.
Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации
белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови,
цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты
различных органов и т. д.

38. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Метод объединяет реакцию преципитации в геле с
электрофорезом.
Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его
разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую
канавку.
В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в
течение 1-2 часов.
Различные антигены с разной скоростью перемещаются между
катодом и анодом.
Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через
5-7 суток в геле образуются зоны преципитации.
Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями
(например, амидо черным).

39. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

40. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
дуги преципитации.

41. Реакция бактериолиза

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА
применяется редко, она используется для
дифференциальной диагностики холерного вибриона от
других холероподобных бактерий.
В основе реакции лежит способность специфических антител
образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе
с бактериями,
что приводит к активации системы комплемента по
классическому пути и лизису бактерий.

42. В реакции гемолиза

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА
антигеном служат эритроциты, антителом –
антигемолитические антитела.
При образовании комплекса антиген-антитело начинается
активация комплемента, в результате чего мутная взвесь
эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную
жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода
гемоглобина.
При постановке диагностической реакции связывания
комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как
индикаторная: для тестирования присутствия или
отсутствия (связывания) свободного комплемента.

43. Реакция лизиса и связывание комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ
КОМПЛЕМЕНТА.
Необходимые антиген, антитело и комплемент.
Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или
другие клетки.
Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку
или сыворотку больного.
В зависимости от того, против каких клеток направленное
действие лизины, они имеют свои названия:
против бактерий - бактериолизины, спирохет спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других
клеток - цитолизины.
Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим
путем и вызывает растворение клетки.
Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают
несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

44. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
При образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда
присоединяется комплемент.
Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то
комплемент не связывается, остается свободным в системе.
При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины
свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз
эритроцитов.
Этот принцип и положено в основу РСК.
При соответствии антигена антителу с ним связывается
комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты
барана и гемолитическую сыворотку.
При отсутствии гемолиза заключают, что реакция
положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

45. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
Опытная система
АНТИГЕН
(Бактерия, клетка, вирус и
т.д.)
КОМПЛЕМЕНТ
АНТИТЕЛО
(сыворотка) Комплемент
связался с комплексом
антиген-антитело
Индикаторная гемолитиче
ская система
ЭРИТРОЦИТЫ
БАРАНА (АНТИГЕН)
ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ
СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)
Комплемента нет - связался
с опытной системой.
Без комплемента гемолиз
эритроцитов
невозможен.

46. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).

47. Критерии учета результатов реакции

++++
Полная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная
РСК.
+++
Неполная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета;
положительная РСК.
++
Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость
красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная
РСК.
+
Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная
РСК.
-
Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная
РСК.

48. (РСК)

49. Определение антирезус - антител в сыворотке.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ.
Данная реакция проводится у беременных женщин,
имеющих отрицательный резус-фактор.
В случае, если у отца ребенка положительный резус-фактор,
то у плода возможен как положительный, так и
отрицательный резус.
Для предотвращения резус-конфликта необходимо знать,
образуются ли антирезус-антитела в течение беременности
и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их
титра.

50. Для постановки данной реакции необходимы следующие ингредиенты

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ
НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Исследуемая сыворотка
Эритроциты человека, несущие положительный резус-фактор
(стандартные эритроциты)
Комплемент.
Этапы постановки теста:
В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки
В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных
эритроцитов
Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе.
В качестве положительного контроля используем сыворотку,
имеющую антирезус-антитела; в качестве отрицательного
контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

51. Учет результата ведется по гемолизу:

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ:
В пробирке с отрицательным контролем
наблюдаем осадок эритроцитов
- В пробирке с положительным контролем
– полный гемолиз, то есть
равномерно окрашенная в красный цвет
жидкость
- В исследуемых образцах при наличии
антирезус-антител – полный гемолиз, при
их отсутствии – осадок эритроцитов.

52. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Реакция широко применяется в вирусологии для
определения вида (типа) возбудителя и титра
вируснейтрализующих антител.
Эти антитела обычно выявляются при
смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой
смеси восприимчивым лабораторным животным
или заражением культуры клеток.
На основании выживания животного в первом
случае или отсутствия цитопатического действия
вируса во втором судят о нейтрализующей
активности сыворотки.

53. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)
Основана на свойстве
антисыворотки подавлять вирусную
гемагглютинацию, так как нейтрализованный
специфическими антителами вирус утрачивает
способность агглютинировать эритроциты.
РТГА широко применяется для серодиагностики
вирусных инфекций с целью обнаружения
специфических антигемагглютининов
и для идентификации многих вирусов по их
гемагглютининам (антигенам).

54. РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ

Участвуют меченые антигены или антитела.
К ним относятся реакции
иммунофлюоресценции,
радиоиммунный
иммуноферментный методы.
По своей чувствительности они превосходят
все описанные выше
серологические реакции.

55. Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу) метод экспресс-диагностики,

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО
КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ,
Для выявления микробных антигенов в
тканях использовали меченую
диагностическую сыворотку, содержащую
антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактерий,
вирусов).
Метку антител производят
флюорохромами(изотиоцианат
флюоресцеина)

56. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

включает использование коммерческих реагентов – антигенов
или антител, маркированных ферментами (например,
пероксидазой или щелочной фосфатазой).
Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках
фиксирован антиген или антитело.
После образования иммунного комплекса в систему вносят
субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к
окрашиванию среды.
В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет
непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с
антителом в специфической фазе,
а не анализировать вторичные проявления взаимодействия –
агглютинацию, преципитацию или гемолиз.
Метод отличает высокая чувствительность – обычно
достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

57. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

58. Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ
ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ):
В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген
ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена
для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо
отрицательной
Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут
Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз
Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против
иммуноглобулинов человека, меченные ферментом
Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз
Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и
бензидин
Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте
Проводим визуальный учет результатов и определение оптической
плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

59. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

При правильной постановке анализа в лунке, содержащей
положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он
становится желтым.
В отрицательном контроле цвет прозрачный.
Учет результатов опытных образцов зависит от изменения
цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в
положительном контроле, значит, у данного пациента
обнаружены антитела к ВИЧ.

60. упрощения использования ИФА «безреагентные» системы

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ
Для проведения анализа необходимо только нанести на носитель
образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя,
происходящее вследствие образования продукта ферментативной
реакции.
Преимущества:
не используются радиоактивные изотопы,
стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение
длительного времени,
измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне,
результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без
применения аппаратуры (визуально).
ИФА очень легко поддается автоматизации.

61. Радиоиммунологический анализ (РИА)

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ (РИА)
Преимущество РИА: отсутствует необходимость оценивать
протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как
агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов.
2 варианта:
меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное
число участков связывания со специфическими антителами.
Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие,
должна существовать определенная степень родства между
меченым и немеченым антигеном.
После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а
затем со стандартным меченым антигеном
количество включившегося в состав иммунных комплексов
меченого антигена будет обратно пропорционально количеству
немеченого антигена в исследуемой пробе..

62. Источники информации:

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
Основные А.
.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология,
иммунология и вирусология. -С-П.,2000.
Медицинская микробиология./ Под ред. В.И. Покровского.М.,
2001.
Л.Б.Борисов.Медицинская
микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001
Медицинская микробиология,вирусология /Под
ред. А.А.Воробьева.М.2004.