ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
РЕАКЦИИ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ФГБОУ
ВО ТГМУ 2016Г

план

ПЛАН
1. Серологические реакции, которые используются
для серологической диагностики.
2.Серологические реакции, которые используются
для серологической идентификации.
3.Современные методы Иммунологических
исследований при инфекционных болезнях:
(Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный
анализ, генодиагностика,
полимеразная цепная реакция).
4.Серологические реакции, которые используются в
вирусологии.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

ВСЕ СЕРОЛОГИЧНЫЕ
РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ
С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ:
для выявления антител в сыворотке больного
с помощью стандартных антигеновдиагностикумов – для серологической
диагностики инфекционной болезни;
для определения неизвестных антигенов
(бактерий, грибов, вирусов) за известными
стандартными сыворотками-антителами –
для серологической идентификации
возбудителей.

классифиация

КЛАССИФИАЦИЯ
Иммунные реакции подразделяются на простые и
сложные. Для их постановки необходимы
основные два компонента: антиген и антитело.
К простым реакциям, применяемым для
диагностики, относятся реакции агглютинации,
реакции преципитации, реакции нейтрализации.
К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный
метод, радиоиммунный метод,
иммуноферментный метод,
иммунолюминесцентный метод исследования,
метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание)
внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок
корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а
также частиц с адсорбированными на них антигенами под
влиянием антител в среде с электролитом.
Реакция протекает в две фазы.
В первой фазе происходит специфическая адсорбция
антител на поверхности клетки или частицы, несущей
соответствующие антигены,
Во второй - образование агрегата (агглютината) и
выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит
только в присутствии электролита (раствор хлорида
натрия).

Агглютинат

АГГЛЮТИНАТ
Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и
крупнохлопчатый.
Мелкозернистый – это результат
взаимодействия мелких бактерий,
крупнохлопчатый – бактерий,
имеющих жгутики.

Реакция агглютинации-типы

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ-ТИПЫ
Все реакции агглютинации
подразделяются на два типа:
ориентировочные (ОРА), которые
выполняются на стекле,
развернутые (РРА) – выполняются в
пробирках с титрованием сыворотки.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И
ЧУВСТВИТЕЛЬНА.
Повысить специфичность и чувствительность
реакции можно путем разведения исследуемой
сыворотки до ее титра или половины титра.
Титром сыворотки называется то ее максимальное
разведение, в котором обнаруживается
агглютинация антигена.
Чем выше титр антител, тем достовернее
результаты реакции.
Чтобы дифференцировать причину
положительной реакции (ранее перенесенная
инфекция, вакцинация или текущее заболевание),
оценивают динамику нарастания титра
антител, которое наблюдается только при
текущей инфекции..

Основные цели

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ
Ориентировочные реакции также могут
иметь две цели:
Идентификация микробного вида (с
использованием известной иммунной
сыворотки).
Поиск антител в сыворотке крови
пациента с использованием известного
микробного диагностикума.

10. Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ

11. ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРА - ориентировочной реакции агглютинации

12. Схема ориентировочной реакции агглютинации.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ
АГГЛЮТИНАЦИИ.
Этапы выполнения реакции:
На обезжиренное стекло нанести
каплю физиологического раствора.
Внести петлей исследуемую культуру
бактерий, равномерно распределить в
капле физиологического раствора
Добавить каплю специфической
агглютинирующей иммунной
сыворотки
Учесть результат реакции.
Положительной считается реакция,
когда в капле происходит
просветление жидкости и
формирование агглютината.

13. ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

++++
Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление
жидкости. Результат положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над
осадком слегка мутновата. Результат положительный
++
Слабая
агглютинация:
осадок
небольшой,
жидкость
непрозрачная.
маленький,
надосадочная
Результат слабоположительный
+
Следы
агглютинации:
осадок
непрозрачная. Сомнительный результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.
жидкость

14. модификации Реакция агглютинации: это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ
МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА.
Реакция Минкевича позволяет определить наличие
противотуляремийных антител у инфицированного
пациента.
Необходимые ингредиенты:
Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора
из пальца больного
Дистиллированная вода
Туляремийный диагностикум.

15. Этапы выполнения реакции Минкевича:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА:
На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента
Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов
Внести каплю туляремийного диагностикума
Учесть результаты.
Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна
агглютината.

16. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить
антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента,
но и определить титр антител.
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка пациента
Физиологический раствор
Бруцеллезный диагностикум

17. Принцип метода

ПРИНЦИП МЕТОДА
основан на использовании большого стекла фотопластины,
концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в
нарастающих или уменьшающихся объёмах,
дополняемой до определённого уровня физиологическим
раствором, что приравнивается к разным разведениям, и
окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей
видимости образующегося агглютината.
Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём
лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при
+37Сº.
На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от
нескольких больных.
Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината
разной активности в зависимости от разведений.

18. реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их сер

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ
ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА
:
Данная реакция основана на способности
родственных групп бактерий адсорбировать из
антисыворотки только групповые антитела при
сохранении в ней типоспецифических антител.
Полученные сыворотки называются монорецепторным,
так как содержат антитела только к одному
определенному антигену.
При наличии у разных бактерий одинаковых или
сходных групповых антигенов они могут
агглютинироваться одной и той же антисывороткой,
что затрудняет их идентификацию.

19.

Принцип метода:
Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител
методом адсорбции
специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и
специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ -
только групповые.
В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют
родственные гетерологические АГ.
Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала
агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым
паратифа А.
Диагностикум с
антигенами
брюшного тифа
(АВСД)
Исследуемая
сыворотка с
антителами
(abcd)
2 часа +37C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
abcd
ABC
D
AT
АГ
2 часа +37 C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
ABCD
ABEF
ABCD
ABEF

20. Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ)
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И
АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ)
Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы
полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в
присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена
или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно
быстро – на протяжении 2-7 мин.
Нагруженные антителами частицы латекса широко
используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.
Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в
сыворотке больного.
Такую модификацию РАЛ используют для выявления
противогриппозных, противокраснушных,
протикоревых антител и т.д.

21. Проведение реакции латекс-аглютинации

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
ЛАТЕКС-АГЛЮТИНАЦИИ

22. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм
Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится
белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG
человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на
стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в
окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых
находится активный центр антитела.

23. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая
одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого
материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и
др.) и стафилококкового диагностикума.
Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на
тёмном фоне должна четко будет просматриваться
мелкозернистая агглютинация стафилококков.

24. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ)
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Основана на способности антител взаимодействовать с
антигеном, фиксированным на различных
эритроцитах, которые при этом агглютинируют.
Для постановки этой реакции необходимо приготовление
эритроцитарного диагностикума.
Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов:
антигенный и антительный.

25. Этапы выполнения реакции:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ:
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка крови
инфицированного
пациента
В лунки планшета внести физиологический
раствор в одинаковом количестве -0,25 мл
для разведения сыворотки
В первую лунку внести сыворотку крови
пациента, разведенную в 50 раз в объеме
0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой
и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и
перенести в следующую лунку
Перемешать содержимое и повторить эту
процедуру во всех лунках, предназначенных
для проведения реакции.
Приготовить контроль, для чего в одну
лунку внести 0,25 мл физиологического
раствора
Во все лунки, включая контрольную,
внести по 2 капли приготовленного
эритроцитарного диагностикума и
перемешать путем осторожного
покачивания планшета.
Физиологический раствор
Эритроцитарный
диагностикум
Реакция пассивной
гемагглютинации
выполняется в лунках
иммунологического
планшета.

26. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на
дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в
опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика».
Схема постановки и учета РПГА

27. Критерии учета результатов реакции

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
++++
Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат
положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна
лунки. Результат положительный
++
Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна
лунки. Результат сомнительный
+
Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный
результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадок занимает центральное
положение с округлыми краями.

28. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ.

.
РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Развернутые реакции агглютинации предложены для
поиска антител в сыворотках крови инфицированных
пациентов при некоторых бактериальных инфекциях.
При этом применяются диагностикумы,
приготовленные из микроорганизмов.
Для выполнения этих реакций необходимо
предварительное титрование сыворотки.

29. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ.
Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора
1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или
1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора
1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или
1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора.
В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора.
8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль
сыворотки и контроль антигена.
В контроль сыворотки вносим только разведенную
сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только
взвесь диагностикума.

30. Учет реакции

УЧЕТ РЕАКЦИИ
Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси
диагностикума.
В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках
просветляется, на дно оседает осадок агглютината.
Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки
должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно
мутная взвесь диагностикума.
Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно
видно формирование осадка агглютината.

31. СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты
Содержимое пробирок
Физиологический
раствор
0,85
Контроль
Сыворотки
Антигена
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
в 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
--
%
хлорида натрия, мл
Сыворотка
разведении 1:50 мл
Разведения
Диагностикум,
млрд.
(1: 50)
1: 100
1-2 2к
1: 200
1: 400
1: 800
-
2к
2к
2к
-
микробных В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при
тел в 1 мл.
комнатной температуре
2к

32. Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ
АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ:
В реакции агглютинации они корпускулярные, даже
целые клетки, а в реакции преципитации –
молекулярные, в растворимом состоянии.
Антигенами могут быть экстракты
микроорганизмов, тканей, органов, химические
вещества.
Феномен преципитации заключается в том, что
антитела (преципитины), соединяясь с
растворимыми антигенами (преципитиногенами),
предопределяют образование осадка (преципитата)
или помутнения раствора.
За титр реакции принимают наибольшее разведение
антигена, которое дает положительный результат.

33. Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО
ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРАКТИКЕ:
В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения
видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду
принадлежит выявленная кровь.
Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для
диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы,
дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской
язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех,
щетина).
Реакцию Ухтерлони используют для определения
антигенного состава органов и тканей, как нормальных,
так и опухолевых, количества антигенов в сложных
системах.
Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других
заболеваний.

34. . Выявление АГ в реакции кольцепреципитации.

. ВЫЯВЛЕНИЕ АГ В РЕАКЦИИ
КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ.

35. Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС).
Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых
обследованиях на сифилис.
В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов,
антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический).
Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета.
Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов
применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген
(контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная
сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата).
В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении
1:10 и кардиолипиновый антиген.
После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем
планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в
лунке становится прозрачной.
Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат,
оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4
++++ - положительным. Схема реакции микропреципитации
представлена на рис. 10.

36. Экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА
СИФИЛИСА (ЭДС).

37. Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ)
Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии
антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена
образуют линии и полосы преципитации.
Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной
диффузии, можно проводить количественное определение
антигенов.
Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и
встречной иммунодиффузии позволяет оценивать
иммунохимическое сходство или различие антигенных
компонентов.
Методы иммунодиффузии характеризуются высокой
специфичностью и чувствительностью.
Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации
белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови,
цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты
различных органов и т. д.

38. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Метод объединяет реакцию преципитации в геле с
электрофорезом.
Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его
разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую
канавку.
В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в
течение 1-2 часов.
Различные антигены с разной скоростью перемещаются между
катодом и анодом.
Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через
5-7 суток в геле образуются зоны преципитации.
Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями
(например, амидо черным).

39. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

40. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
дуги преципитации.

41. Реакция бактериолиза

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА
применяется редко, она используется для
дифференциальной диагностики холерного вибриона от
других холероподобных бактерий.
В основе реакции лежит способность специфических антител
образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе
с бактериями,
что приводит к активации системы комплемента по
классическому пути и лизису бактерий.

42. В реакции гемолиза

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА
антигеном служат эритроциты, антителом –
антигемолитические антитела.
При образовании комплекса антиген-антитело начинается
активация комплемента, в результате чего мутная взвесь
эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную
жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода
гемоглобина.
При постановке диагностической реакции связывания
комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как
индикаторная: для тестирования присутствия или
отсутствия (связывания) свободного комплемента.

43. Реакция лизиса и связывание комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ
КОМПЛЕМЕНТА.
Необходимые антиген, антитело и комплемент.
Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или
другие клетки.
Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку
или сыворотку больного.
В зависимости от того, против каких клеток направленное
действие лизины, они имеют свои названия:
против бактерий - бактериолизины, спирохет спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других
клеток - цитолизины.
Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим
путем и вызывает растворение клетки.
Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают
несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

44. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
При образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда
присоединяется комплемент.
Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то
комплемент не связывается, остается свободным в системе.
При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины
свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз
эритроцитов.
Этот принцип и положено в основу РСК.
При соответствии антигена антителу с ним связывается
комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты
барана и гемолитическую сыворотку.
При отсутствии гемолиза заключают, что реакция
положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

45. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
Опытная система
АНТИГЕН
(Бактерия, клетка, вирус и
т.д.)
КОМПЛЕМЕНТ
АНТИТЕЛО
(сыворотка) Комплемент
связался с комплексом
антиген-антитело
Индикаторная гемолитиче
ская система
ЭРИТРОЦИТЫ
БАРАНА (АНТИГЕН)
ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ
СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)
Комплемента нет - связался
с опытной системой.
Без комплемента гемолиз
эритроцитов
невозможен.

46. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).

47. Критерии учета результатов реакции

++++
Полная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная
РСК.
+++
Неполная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета;
положительная РСК.
++
Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость
красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная
РСК.
+
Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная
РСК.
-
Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная
РСК.

48. (РСК)

49. Определение антирезус - антител в сыворотке.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ.
Данная реакция проводится у беременных женщин,
имеющих отрицательный резус-фактор.
В случае, если у отца ребенка положительный резус-фактор,
то у плода возможен как положительный, так и
отрицательный резус.
Для предотвращения резус-конфликта необходимо знать,
образуются ли антирезус-антитела в течение беременности
и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их
титра.

50. Для постановки данной реакции необходимы следующие ингредиенты

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ
НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Исследуемая сыворотка
Эритроциты человека, несущие положительный резус-фактор
(стандартные эритроциты)
Комплемент.
Этапы постановки теста:
В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки
В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных
эритроцитов
Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе.
В качестве положительного контроля используем сыворотку,
имеющую антирезус-антитела; в качестве отрицательного
контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

51. Учет результата ведется по гемолизу:

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ:
В пробирке с отрицательным контролем
наблюдаем осадок эритроцитов
- В пробирке с положительным контролем
– полный гемолиз, то есть
равномерно окрашенная в красный цвет
жидкость
- В исследуемых образцах при наличии
антирезус-антител – полный гемолиз, при
их отсутствии – осадок эритроцитов.

52. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Реакция широко применяется в вирусологии для
определения вида (типа) возбудителя и титра
вируснейтрализующих антител.
Эти антитела обычно выявляются при
смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой
смеси восприимчивым лабораторным животным
или заражением культуры клеток.
На основании выживания животного в первом
случае или отсутствия цитопатического действия
вируса во втором судят о нейтрализующей
активности сыворотки.

53. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)
Основана на свойстве
антисыворотки подавлять вирусную
гемагглютинацию, так как нейтрализованный
специфическими антителами вирус утрачивает
способность агглютинировать эритроциты.
РТГА широко применяется для серодиагностики
вирусных инфекций с целью обнаружения
специфических антигемагглютининов
и для идентификации многих вирусов по их
гемагглютининам (антигенам).

54. РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ

Участвуют меченые антигены или антитела.
К ним относятся реакции
иммунофлюоресценции,
радиоиммунный
иммуноферментный методы.
По своей чувствительности они превосходят
все описанные выше
серологические реакции.

55. Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу) метод экспресс-диагностики,

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО
КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ,
Для выявления микробных антигенов в
тканях использовали меченую
диагностическую сыворотку, содержащую
антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактерий,
вирусов).
Метку антител производят
флюорохромами(изотиоцианат
флюоресцеина)

56. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

включает использование коммерческих реагентов – антигенов
или антител, маркированных ферментами (например,
пероксидазой или щелочной фосфатазой).
Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках
фиксирован антиген или антитело.
После образования иммунного комплекса в систему вносят
субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к
окрашиванию среды.
В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет
непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с
антителом в специфической фазе,
а не анализировать вторичные проявления взаимодействия –
агглютинацию, преципитацию или гемолиз.
Метод отличает высокая чувствительность – обычно
достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

57. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

58. Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ
ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ):
В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген
ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена
для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо
отрицательной
Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут
Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз
Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против
иммуноглобулинов человека, меченные ферментом
Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз
Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и
бензидин
Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте
Проводим визуальный учет результатов и определение оптической
плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

59. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

При правильной постановке анализа в лунке, содержащей
положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он
становится желтым.
В отрицательном контроле цвет прозрачный.
Учет результатов опытных образцов зависит от изменения
цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в
положительном контроле, значит, у данного пациента
обнаружены антитела к ВИЧ.

60. упрощения использования ИФА «безреагентные» системы

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ
Для проведения анализа необходимо только нанести на носитель
образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя,
происходящее вследствие образования продукта ферментативной
реакции.
Преимущества:
не используются радиоактивные изотопы,
стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение
длительного времени,
измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне,
результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без
применения аппаратуры (визуально).
ИФА очень легко поддается автоматизации.

61. Радиоиммунологический анализ (РИА)

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ (РИА)
Преимущество РИА: отсутствует необходимость оценивать
протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как
агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов.
2 варианта:
меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное
число участков связывания со специфическими антителами.
Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие,
должна существовать определенная степень родства между
меченым и немеченым антигеном.
После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а
затем со стандартным меченым антигеном
количество включившегося в состав иммунных комплексов
меченого антигена будет обратно пропорционально количеству
немеченого антигена в исследуемой пробе..

62. Источники информации:

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
Основные А.
.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология,
иммунология и вирусология. -С-П.,2000.
Медицинская микробиология./ Под ред. В.И. Покровского.М.,
2001.
Л.Б.Борисов.Медицинская
микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001
Медицинская микробиология,вирусология /Под
ред. А.А.Воробьева.М.2004.

Взаимодействие in vitro между специфическими антигенами и антителами называют иммунологической реакцией, которая состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab -фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

В микробиологии и иммунологии применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия специфических антигенов с антител и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Иммунологические реакции характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Серологический метод.

От латинского serum ¾ сыворотка: серология ¾ раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия АГ и AT сыворотки крови. Соответственно реакции АГ+АТ, происходящие in vitro, называются серологическими реакциями. Серология имеет огромное прикладное и практическое значение в современной клинической лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний.

Серологический метод исследования (диагностики) ¾ это метод, основанный на изучении сыворотки больного с целью определения в ней антител. В настоящее время понятие серологического метода расширено, так как разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение AT не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях: слюне, ликворе, биосекретах).

Основные характеристики:

1) взаимодействие АГ и AT строго специфично;

2) серологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и AT;

3) серологическая реакция имеет двухфазный характер:

· специфическое взаимодействие ¾ фаза невидимая;

· образование видимых комплексов ¾– для этого добавляют физиологический раствор;

4) серологическая реакция проходит по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

5) выделяется небольшое количество тепла.

Цели применения серологических реакций:

1) серологическая идентификация - это определение вида неизвестного АГ при помощи известных AT (иммунной диагностической сыворотки). В этом случае:

а) неизвестные АГ ¾ это микроорганизмы патогенные и непатогенные, токсины разного происхождения, белки крови, клетки разных органов и ткани другого вида или группы, клетки трансплантанта;

б) известные AT ¾ это стандартные препараты ¾ иммунные диагностические сыворотки (ИДС) специфичные определённому (искомому) АГ

2) серологическая диагностика (метод) ¾ это определение неизвестных AT в сыворотке крови или других биологических жидкостях больного с помощью известного АГ (диагностикума).

а) неизвестные AT ¾ это искомые AT сыворотки крови людей ¾ больных, переболевших, носителей, вакцинированных;

б) диагностикумы ¾ это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их АГ. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивацию проводят: нагреванием, формалином, спиртом и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет антигенные свойства).

Основные понятия серологии Диагностикум ¾взвесь убитых микробов. Титр антител ¾наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором произошла положительная реакция (агглютинации, связывания комплемента и т.п.). Диагностический титр ¾наименьший титр специфических антител у больного данной инфекцией человека, с которого реакция может считаться специфической (положительной). Парные сыворотки ¾двесыворотки одного пациента, первая из которых берется на 5-8 день заболевания, вторая ¾ через 10-14 дней, с целью оценить динамику иммунного ответа. Феномен нарастания титра антител ¾увеличение концентрации специфических антител в исследуемых парных сыворотках в 4 и более раз, свидетельствующее о наличие данного заболевания у человека в данный момент.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) (лат. agglutinatio ¾ склеивание) реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных (нерастворимых) антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: определения антител в сыворотке крови больных (например, при бруцеллезе ¾ реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекциях), идентификации возбудителя, выделенного от больного;

Для определения у больного антител ставятразвернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум и через 2 часа инкубации при 37 °С и 18-20 часов при комнатной температуре отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и Н-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении с физиологическим раствором 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без комков.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации , основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;

ПЛАН q 1. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики. q 2. Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. q 3. Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях: (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакция). q 4. Серологические реакции, которые используются в вирусологии. q

РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ: q для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; q для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками антителами – для серологической идентификации возбудителей.

КЛАССИФИАЦИЯ q Иммунные реакции подразделяются на простые и сложные. Для их постановки необходимы основные два компонента: антиген и антитело. q К простым реакциям, применяемым для диагностики, относятся реакции агглютинации, реакции преципитации, реакции нейтрализации. q К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод, иммунолюминесцентный метод исследования, метод иммуноблотинга.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ q Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. q Реакция протекает в две фазы. q В первой фа зе происходит специфическая дсорбция а антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, q Во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

АГГЛЮТИНАТ q Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и крупнохлопчатый. q Мелкозернистый – это результат взаимодействия мелких бактерий, q крупнохлопчатый – бактерий, имеющих жгутики.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ТИПЫ q Все реакции агглютинации подразделяются на два типа: q ориентировочные (ОРА), которые выполняются на стекле, q развернутые (РРА) – выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И ЧУВСТВИ ТЕЛЬНА. q Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. q Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. q Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. q Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции. .

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ q Ориентировочные реакции также могут иметь две цели: q Идентификация микробного вида (с использованием известной иммунной сыворотки). q Поиск антител в сыворотке крови пациента с использованием известного микробного диагностикума.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Этапы выполнения реакции: v На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора. v Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно распределить в капле физиологического раствора v Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки v Учесть результат реакции. v Положительной считается реакция, когда в капле происходит просветление жидкости и формирование агглютината.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА + + Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление жидкости. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над осадком слегка мутновата. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок небольшой, жидкость непрозрачная. Результат слабоположительный + Следы агглютинации: осадок маленький, надосадочная жидкость непрозрачная. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ. МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА v Реакция Минкевича позволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента. v Необходимые ингредиенты: v Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора из пальца больного v Дистиллированная вода v Туляремийный диагностикум.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА: v На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента v Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов v Внести каплю туляремийного диагностикума v Учесть результаты. v Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна агглютината.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител. Необходимые ингредиенты: v Сыворотка пациента v Физиологический раствор v Бруцеллезный диагностикум

ПРИНЦИП МЕТОДА v основан на использовании большого стекла фотопластины, v концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, v дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и v окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. v Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37 Сº. v На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. v Результат получают через 2 5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА: q Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. q При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию.

Принцип метода: v Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции v специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ - только групповые. v В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. v Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ) ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ) q Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром 0, 5 1, 2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2 7 мин. q Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий. q Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. q Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т. д.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту Ig. G человека и кролика. Поэтому молекулы Ig. G после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). q Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1 2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. q Смесь тщательно перемешивают и через 2 5 мин. на тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ v Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. v Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарного диагностикума. v Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов: антигенный и антительный.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ: Необходимые ингредиенты: q Сыворотка крови инфицированного пациента q В лунки планшета внести физиологический раствор в одинаковом количестве 0, 25 мл для разведения сыворотки q В первую лунку внести сыворотку крови пациента, разведенную в 50 раз в объеме 0, 25 мл; перемешать содержимое пипеткой и этой же пипеткой набрать 0, 25 мл и перенести в следующую лунку q Перемешать содержимое и повторить эту процедуру во всех лунках, предназначенных для проведения реакции. q Приготовить контроль, для чего в одну лунку внести 0, 25 мл физиологического раствора q Во все лунки, включая контрольную, внести по 2 капли приготовленного эритроцитарного диагностикума и перемешать путем осторожного покачивания планшета. q Физиологический раствор q Эритроцитарный диагностикум q Реакция пассивной гемагглютинации выполняется в лунках иммунологического планшета.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ Положительной считается проба, когда в лунках планшета на дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки» , а в опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика» . Схема постановки и учета РПГА

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ + + Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна лунки. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна лунки. Результат сомнительный + Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадок занимает центральное положение с округлыми краями.

. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ v Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. v При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. v Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ. Разведение 1: 10 это 1 мл сыворотки + 9 мл физ. раствора 1: 50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или 1: 50 это 0, 1 мл сыворотки + 4, 9 мл физ. раствора 1: 100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или 1: 100 это 0, 1 мл сыворотки +9, 9 мл физ. раствора. v В 10 пробирок вносим по 2, 5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. v В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2, 5 мл, в контроль антигена только взвесь диагностикума.

УЧЕТ РЕАКЦИИ v Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. v В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. v Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена равномерно мутная взвесь диагностикума. v Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ) Ингредиенты Содержимое пробирок Контроль Сыворотки Физиологический раствор 0, 85 Антигена 0, 5 - 0, 5 в 0, 5 0, 5 % хлорида натрия, мл Сыворотка разведении 1: 50 мл Разведения Диагностикум, (1: 50) 1: 100 1 2 2 к 1: 200 1: 400 1: 800 - 2 к 2 к 2 к - 2 к млрд. микробных тел В термостат при +37 С° на 2 часа, затем на 18 20 часов при в 1 мл. комнатной температуре

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ: q В реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. q Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества. q Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. q За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ: q В судебно медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. q Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). q Реакцию Ухтерлони используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. q Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС). q Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис. q В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов, антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический). Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета. Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген (контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата). q В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении 1: 10 и кардиолипиновый антиген. q После смешивания реагентов в течение 2 5 минут осторожно покачиваем планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в лунке становится прозрачной. q Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат, оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4 ++++ положительным. Схема реакции микропреципитации представлена на рис. 10.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ) Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агара с раствором антигена образуют линии и полосы преципитации. q Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. q Взаимное рас положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. q Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. q Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак ты различных органов и т. д.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ q Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. q Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. q В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1 2 часов. q Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. q Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5 7 суток в геле образуются зоны преципитации. q Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА q применяется редко, она используется для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других холероподобных бактерий. q В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с бактериями, q что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису бактерий.

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА q антигеном служат эритроциты, антителом – антигемолитические антитела. q При образовании комплекса антиген антитело начинается активация комплемента, в результате чего мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода гемоглобина. q При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА. q Необходимые антиген, антитело и комплемент. q Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. q Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. q В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: q против бактерий бактериолизины, спирохетолизины, эритроцитов гемолизины, против других клеток цитолизины. q Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. q Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). q При образовании комплекса антиген антитело к нему всегда присоединяется комплемент. q Если антиген и антитело не отвечают другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. q При добавлении комплекса эритроциты барана гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. q Этот принцип и положено в основу РСК. q При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. q При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза реакция негативная.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). Опытная система АНТИГЕН (Бактерия, клетка, вирус и т. д.) КОМПЛЕМЕНТ АНТИТЕЛО (сыворотка) Комплемент связался с комплексом антиген-антитело Индикаторная гемолитиче ская система ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА (АНТИГЕН) ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО) Комплемента нет - связался с опытной системой. Без комплемента гемолиз эритроцитов невозможен.

Критерии учета результатов реакции + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК. + + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК. + + Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость красно розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК. + Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК. Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС - АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ. q Данная реакция проводится у беременных женщин, имеющих отрицательный резус фактор. q В случае, если у отца ребенка положительный резус фактор, то у плода возможен как положительный, так и отрицательный резус. q Для предотвращения резус конфликта необходимо знать, образуются ли антирезус антитела в течение беременности q и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их титра.

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ q Исследуемая сыворотка q Эритроциты человека, несущие положительный резус фактор (стандартные эритроциты) q Комплемент. q Этапы постановки теста: q В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки q В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных эритроцитов q Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе. q В качестве положительного контроля используем сыворотку, имеющую антирезус антитела; в качестве отрицательного контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ: q В пробирке с отрицательным контролем наблюдаем осадок эритроцитов q В пробирке с положительным контролем – полный гемолиз, то есть q равномерно окрашенная в красный цвет жидкость q В исследуемых образцах при наличии антирезус антител – полный гемолиз, при их отсутствии – осадок эритроцитов.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ q Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз будителя и титра вируснейтрализующих антител. q Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. q На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су дят о нейтрализующей активности сыворотки.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА) q q Основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (анти генам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ q Участвуют меченые антигены или антитела. q К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, q ра диоиммунный q иммуноферментный методы. q По своей чувстви тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ, q Для выявления микробных антигенов в тканях использовали меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов). q Метку антител производят флюорохромами(изотиоцианат флюоресцеина)

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q включает использование коммерческих реагентов – антигенов или антител, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). q Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках фиксирован антиген или антитело. q После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды. q В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, q а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. q Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ): q В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо отрицательной q Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут q Промываем лунки планшета фосфатно солевым буфером 5 раз q Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом q Промываем лунки фосфатно солевым буфером 5 раз q Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин q Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте q Проводим визуальный учет результатов и определение оптической плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет он становится желтым. q В отрицательном контроле цвет прозрачный. q Учет результатов опытных образцов зависит от изменения цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в положительном контроле, значит, у данного пациента обнаружены антитела к ВИЧ.

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ q Для проведения анали за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед ствие образования продукта ферментативной реакции. q Преимущества: q не используются радиоактивные изотопы, q стабиль ность онъюгатов позволяет хранить их в течение к длительного времени, q измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, q результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). q ИФА очень легко под дается автоматизации.

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (РИА) q Преимущество РИА: отсутствует необ ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро цитов. q 2 варианта: q меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе цифическими антителами. q Для того чтобы происходило конку рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. q После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном q количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе мой пробе. .

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ: Основные А. §. Коротяев А. И. , Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П. , 2000. § Медицинская микробиология. / Под ред. В. И. Покровского. М. , 2001. § Л. Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М. , 2001 § Медицинская микробиология, вирусология /Под ред. А. А. Воробьева. М. 2004.

7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.

8. Секреторные рецепторы врожденного иммунитета.

9. Система комплемента

10. Роль белков теплового шока и острой фазы.

11. Характеристика антимикробных пептидов и их продуцентов.

12. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

13. Роль и. И. Мечникова в формировании учения об иммуните­те. Неспецифические факторы защиты организма.

14. Клеточные факторы врожденного иммунитета (макрофаги, нейтрофилы, естесственные киллеры, дендритные клетки, тучные клетки, базофилы, nk и др.).

15. Фагоцитоз (стадии фагоцитоза, кислородный взрыв и др.)

16. Функции естественных киллеров.

17. Мембранные и цитозольные рецепторы врожденного иммунитета (tlr, nlr, rig). См. Ответ 7.

18. Классификация и характеристика дендритных клеток.

21. Антигены микробов и клеток человека (cd, mhc). Гаптены

22. Характеристика Th1, Th2, Th17 и Treg-лимфоцитов.

23. Иммунокомпетентные клетки; t- и в-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки.

25. Презентация антигена. Кооперация, основные принципы дифференцировки т- и в-лимфоцитов.

26. Формы иммуного ответа. Регуляция иммунного ответа.

27)Теории иммунитета. Генетика формирования т и в-клеточных рецепторов.

28) Иммунологическая толерантность,механизмы

29)Клеточный иммунный ответ (цитотоксический и воспалительный иммунный ответ, роль цитокинов, т-хелперов и макрофагов)

30)Гуморальный иммунный ответ (роль цитокинов, Th-2лимфоцитов и в-лимфоцитов).

31) Антитела. Классы, структура и функции иммуноглобулинов.

32) Антигенные свойства иммуноглобулинов, изотипы, аллотипы, идиотипы. Полные и неполные антитела.

33) Моноклональные антитела.Получение(гибридомная технология) и применение.

34) Генетика антителообразования.

35) Иммунологическая память. Первичный и вторичный ответ.

36) Мех-мы противоинфекционного (противобактериального и противовирусного) иммунитета

37) Мех-мы противогельминтного, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

38)Гиперчувствительность немедленного типа. Мех-мы возникновения,клиническая значимость.

39) Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения.Механизм.Их предупреждение.Аллергоспецифическая иммунотерапия.

40. Механизм гиперчувствительности замедленного типа. Клинико-диагностическое значение

44. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.

45. Механизмы развития аутоиммуных реакций.

46. Практическое использование серологических реакций.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

50. Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение.

51. Реакция коагглютинации. Механизм, компоненты. Применение.

53. Реакция преципитации

54. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

55. Реакция связывания комплемента

56. Реакция нейтрализации

57. Реакция иммунофлюоресценции (риф,методКунса)

58. Иммуноферментный метод или анализ

59. Иммунная электронная микроскопия

60. Проточная цитометрия

61. Серологические реакции, используемые для диагнос­тики вирусных инфекций.

62. Диагностикумы. Получение, применение.

63. Моноклональные антитела. Получение, применение.

64 Методы приготовления и применения агглютинирую­щих, адсорбированных сывороток.

65 Вакцины

4.2.5.1. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины

46. Практическое использование серологических реакций.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы).

Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:

1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;

2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:

Оптимального соотношения АГ и АТ;

Степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);

Концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченые АГ и АТ (р. иммунофлюорес-ценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).

48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение .

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

49. Реакция Кумбса - антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Тест Кумбса используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов.

Суть данного метода заключается в том, что антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека, при реакции с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, приводит к их агглютинации.

В зависимости от того, фиксированы ли антитела на поверхности эритроцитов или находятся в свободном состоянии в плазме крови, применяется прямая или непрямая проба Кумбса.

Прямая проба Кумбса ставится в тех случаях, когда есть основания предполагать, что исследуемые красные кровяные клетки уже in vivo подверглись сенсибилизации соответствующими антителами, т.е. первая фаза реакции - фиксация антител на поверхности эритроцитов - произошла в организме и последующее добавление антиглобулиновой сыворотки вызывает агглютинацию сенсибилизированных клеток.

С помощью непрямой пробы Кумбса выявляют неполные антитела, присутствующие в исследуемой сыворотке. В данном случае реакция протекает в два этапа. Первый этап - инкубация тест-эритроцитов с исследуемой сывороткой, во время которой происходит фиксация на эритроцитарной поверхности антител, содержащихся в исследуемом образце сыворотки. Второй этап - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция Кумбса прямая (прямой антиглобулиновый тест)

Материал для исследования: кровь из локтевой вены.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме реакция Кумбса отрицательна

Метод исследования: гельфильтрации

Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Положительная прямая реакция Кумбса подразумевает, что in vivo эритроциты покрыты иммуноглобулинами или комплементом. Полиспецифические и анти-IgG реагенты позволяют выявить примерно 500 молекул IgG на эритроците, но имеются сведения, что при аутоиммунной гемолитической анемии эритроциты покрыты меньшим количеством иммуноглобулинов.

Положительно при :

аутоиммунном гемолизе;

гемолитической болезни новорожденных;

лекарственной иммунной гемолитической анемии;

гемолитических трансфузионных реакциях.

Реакция Кумбса непрямая

Материал для исследования - кровь из локтевой вены. сывовротка должна быть быстро отделена от крови.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме: отрицательно.

Метод: гельфильтрации

Непрямая реакция Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Демонстрирует присутствие в плазме пациента неожидаемых антител к АВО- и резуссовместимым эритроцитам. Агглютинация показывает, что сыворотка содержит антитела к антигенам, имеющимся на поверхности реагентных эритроцитов.

Непрямую реакцию применяют в следующих случаях:

для определения индивидуальной совместимости крови донора и реципиента;

для выявления аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции;

для определения поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине;

для подтверждения однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Положительно при:

присутствии аллоантител;

присутствии аутоантител.