Однослойные культуры клеток. Технологии биотехнологии: клеточные культуры

К.К. – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма.

Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей invivo.

Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и перевиваемые.

Первично-трипсинизированные. Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения invitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток .

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:

· высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);

· морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);

· отсутствие трахеидоподобных элементов.

Диплоидные клеточные штаммы . Это клетки одного типа, которые способны претерпевать invitro до 100 делений, сохраняя при этом сбой исходный диплоидный набор хромосом (Хейфлик, 1965). Диплоидные штаммы фибробластов, полученные из эмбрионов человека, широко используются в диагностической вирусологии и при производстве вакцин, а также применяются в экспериментальных исследованиях. Следует иметь в виду, что некоторые возможности вирусного генома реализуются лишь в клетках, сохраняющих нормальный уровень дифференцировки.

130. Бактериофаги. Морфология и химический состав

Бактериофа́ги (фаги) (от др.-греч. φᾰγω - «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм.

Структура частиц – вирионов – разных бактериофагов paзлична. В отличие от вирусов эукариотов бактериофаги часто обладают специализированным органом прикрепления к поверхности бактериальной клетки, или хвостовым отростком, устроенным с разной степенью сложности, но некоторые фаги не имеют хвостового отростка. Капсид содержит генетический материал фага, его геном. Генетический материал разных фагов может быть представлен разными нуклеиновыми кислотами. Некоторые фаги содержат ДНК в качестве генетического материала, другие – РНК. Геном у большинства фагов – двунитевые ДНК, а геном некоторых относительно редких фагов – однонитевые ДНК. На концах молекул ДНК некоторых фагов присутствуют «липкие участки» (однонитевые комплементарные последовательности нуклеотидов), у других фагов липкие участки отсутствуют. У некоторых фагов последовательности генов в молекулах ДНК уникальны, тогда как у других фагов выявлены пермутации генов. У одних фагов ДНК линейная, у других – замкнутая в кольцо. У некоторых фагов на концах молекулы ДНК имеются концевые повторы нескольких генов, у других фагов такая концевая избыточность обеспечивается присутствием относительно коротких повторов. Наконец, у некоторых фагов геном представлен набором из нескольких фрагментов нуклеиновой кислоты.

С эволюционной точки зрения бактериофаги, использующие столь разные типы генетического материала, различаются между собой в существенно большей степени, чем любые другие представители эукариотических организмов. Вместе с тем, Несмотря на такие принципиальные отличия в структуре и свойствах носителей генетической информации – нуклеиновых кислотах, разные бактериофаги проявляют общность во многих отношениях, прежде всего по характеру вмешательства в клеточный метаболизм после заражения чувствительных бактерий.

Бактериофаги, способные вызвать продуктивную инфекцию клеток, т.е. инфекцию, завершающуюся образованием жизнеспособного потомства, определяют как недефектные. Для всех недефектных фагов свойственно два состояния: состояние внеклеточного, или свободного, фага (иногда его называют также зрелым фагом) и состояние вегетативного фага. Для некоторых так называемых умеренных фагов возможно еще и состояние профага.

Внеклеточный фаг – это частицы, обладающие структурой, свойственной фагу данного типа, обеспечивающей сохранение генома фага в период между инфекциями и введение его в очередную чувствительную клетку. Внеклеточный фаг биохимически инертен, а вегетативный фаг – активное («живое») состояние фага, возникает после инфекции чувствительных бактерий или после индукции профага.

Иногда инфекция чувствительных клеток недефектным фагом не завершается образованием жизнеспособного потомства. Это может быть в двух случаях: при абортивной инфекции или вследствие лизогенного состояния клетки при инфекции умеренным фагом.

Причиной абортивного характера инфекции может быть активное вмешательство тех или иных систем клетки в ход инфекции, например разрушение введенного в бактерию генома фага, или отсутствие в клетке какого-то продукта, необходимого для развития фага, и т.д.

Фаги принято относить к трем типам. Тип определяется характером влияния продуктивной инфекции фага на судьбу инфицированной клетки.

Первый тип – истинно вирулентные фаги. Инфекция клетки вирулентным фагом неизбежно ведет к гибели инфицированной клетки, ее разрушению и освобождению фага-потомства (исключая случаи абортивной инфекции). Такие фаги называют истинно вирулентными, для отличия их от вирулентных мутантов умеренных фагов.

Второй тип – умеренные фаги. В ходе продуктивной инфекции клетки умеренным фагом возможны два принципиально разных пути его развития: литический , в общем (по своему исходу) подобный литическому циклу вирулентных фагов, и лизогенный , когда геном умеренного фага переходит в особое состояние – профаг. Клетка, несущая профаг, называется лизогенной или просто лизогеном (поскольку в определенных условиях она может претерпеть литическое развитие фага). Умеренные фаги, отвечающие в состоянии профага на применение индуцирующего фактора началом литического развития, называют индуцибельными, а фаги, не реагирующим таким образом, – неиндуцибельными. У умеренных фагов могут возникать вирулентные мутанты. Мутации вирулентности ведут к такому изменению последовательности нуклеотидов в оператор ных участках, которое сказывается в утрате сродства к репрессору.

Третий тип фагов – это фаги, продуктивная инфекция которыми не ведет к гибели бактерий. Эти фаги способны покидать инфицированную бактерию, не вызывая ее физического разрушения. Клетка, инфицированная таким фагом, находится в состоянии постоянной (перманентной) продуктивной инфекции. Развитие фага сказывается в некотором замедлении скорости делений бактерий.

Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток.

Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2 - 4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал - одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруженная белковой или липопротеиновой оболочкой - капсидом, сохраняющим геном вне клетки.

Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Бактериофаги могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Обычно углы состоят из пентамеров белка, а опора каждой стороны из гексамеров того же или сходного белка. Более того, фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные. Хвост представляет собой белковую трубку - продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, которая регенерирует энергию для инъекции генетического материала. Существуют также бактериофаги с коротким отростком, не имеющие отростка и нитевидные.

Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты - дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%).

Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-овые и РНК-овые. Количество белка и нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно.

Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые преимущественно нейтральные жиры.

Иллюстрация 1: Схема строения фаговой частицы.

Все известные фаги второго морфологического типа РНК-овые. Среди фагов третьего морфологического типа встречаются как РНК-овые, так и ДНК-овые формы. Фаги остальных морфологических типов - ДНК-овые.

131. Интерферон. Что это такое?

Интерфер он (от лат. inter - взаимно, между собой и ferio - ударяю, поражаю), защитный белок, вырабатываемый клетками в организме млекопитающих и птиц, а также культурами клеток в ответ на заражение их вирусами; подавляет размножение (репликацию) вирусов в клетке. И. открыт в 1957 английским учёными А. Айзексом и Дж. Линденманом в клетках инфицированных кур; позднее выяснилось, что образование И. вызывают также бактерии, риккетсии, токсины, нуклеиновые кислоты, синтетические полинуклеотиды. И. - не индивидуальное вещество, а группа низкомолекулярных белков (молекулярная масса 25000-110000), которые стабильны в широкой зоне pH, устойчивы к нуклеазам, разрушаются протеолитическими ферментами. Образование в клетках И. связано с развитием в них вируса, т. е. представляет собой реакцию клетки на проникновение чужеродной нуклеиновой кислоты. После исчезновения из клетки инфицирующего вируса и в нормальных клетках И. не обнаруживается. По механизму действия И. принципиально отличается от антител: он не специфичен по отношению к вирусным инфекциям (действует против разных вирусов), не нейтрализует инфекционность вируса, а угнетает его размножение в организме, подавляя синтез вирусных нуклеиновых кислот. При попадании в клетки после развития в них вирусной инфекции И. не эффективен. Кроме того, И., как правило, специфичен для образующих его клеток; например, И. клеток кур активен только в этих клетках, но не подавляет размножение вируса в клетках кролика или человека. Полагают, что на вирусы действует не сам И., а другой белок, вырабатываемый под его влиянием. Обнадёживающие результаты получены при испытании И. для профилактики и терапии вирусных заболеваний (герпетическая инфекция глаз, грипп, цитомегалия). Однако широкое клиническое применение И. ограничивается трудностью получения препарата, необходимостью многократного введения в организм и его видовой специфичностью.

132. Дизъюктивный способ. Что это такое?

1.Продуктивная вирусная инфекция осуществляется в 3 периода:

· начальный период включает стадии адсорбции вируса на клетке, проникновения в клетку, дезинтеграции (депротеинизации) или "раздевания" вируса. Вирусная нуклеиновая кислота была доставлена в соответствующие клеточные структуры и под дей­ствием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникаль­ная биологическая структура: инфицированная клетка содер­жит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный);

После этого начинается вторая группа процессов репродукции вируса, включающая средний и заключительный периоды, во время которых происходят репрессия клеточного и экспрессия вирусного генома. Репрессию клеточного генома обеспечивают низкомолекулярные регуляторные белки типа гистонов, синтезируемые в любой клетке. При вирусной инфекции этот про­цесс усиливается, теперь клетка представляет собой структуру, в которой генетический аппарат представлен вирусным геномом, а синтетический аппарат - синтетическими системами клетки.

2. Дальнейшее течение событий в клетке направлено на репликацию вирусной нуклеиновой кислоты (синтез генетического материала для новых вирионов) и реализацию содержащейся в ней генети­ческой информации (синтез белковых компонентов для новых вирионов). У ДНК-содержащих вирусов, как в прокариотиче-ских, так и в эукариотических клетках, репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При этом у однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуется комплементарная нить - так назы­ваемая репликативная форма, которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК.

3. Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зави­симой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые по­ступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспе-цифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина, это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу.

У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуще­ствляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус-, так и плюс-нитей, осуществляется через репликативную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза - это геном­ный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Ре­пликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс-нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул ви­русной РНК (минус-нитей), но и выполняет функции и-РНК, т. е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляцию).

У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансля­ции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется че­рез репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз.

У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется со­вершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечива­ется специфическим вирусным ферментом - ревертазой (обрат­ной транскриптазой) и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что вначале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется,вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С не­го обычным путем через образование и-РНК происходит реа­лизация информации вирусного генома.

Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты и вирусных белков, закодированных в геноме вируса.

После этого наступает третий, заключительный период взаимо­действия вируса и клетки. Из структурных компонентов (нук­леиновых кислот и белков) на мембранах цитоплазматического ретикулума клетки собираются новые вирионы. Клетка, геном которой был репрессирован (подавлен), обычно гибнет. Вновь сформировавшиеся вирионы пассивно (в результате гибели клетки) или активно (путем почкования) покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.

Таким образом, синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходят в определенной последова­тельности (разобщены во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пространстве), в связи с чем способ репро­дукции вирусов и был назван дизъюнктивным (разобщенным). При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализова­на не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка со­храняет свои функции неизменными.

При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточно­го, функционирует и наследуется вместе с ним.

133. Вирус оспы верблюдов

Оспа (Variola) - инфекционная контагиозная болезнь, характеризующаяся лихорадкой и папулезно-пустулезной сыпью на коже и слизистых оболочках.
Возбудители болезни принадлежат к различным родам и видам вирусов семейства оспы (Poxviridae). Самостоятельными видами являются вирусы: натуральной юспы коров, осповакцины (род Orthopoxvirus), натуральной оспы овец, коз (род Carpipoxvirus), свиней (род Suipoxvirus), птиц (род Avipoxvirus) с тремя основными видами (возбудители оспы кур, голубей и канареек).
Возбудители оспы у различных видов животных морфологически сходны. Это ДНК-содержащие вирусы, характеризующиеся относительно большими размерами (170 - 350 нм), эпителиотропностью и способностью образовывать в клетках элементарные округлые включения (тельца Пашена, Гварниели, Боллингера), видимые з световом микроскопе после окраски по Моро-зову Хотя и имеется филогенети--еское родство между возбудителями оспы у различных видов животных, спектр « патогенности неодинаков и иммуногенные связи сохранились не во всех случаях. Вирусы натуральной оспы овец, коз, свиней и птиц патогенны только для соответствующего вида, и в естественных условиях каждый из них вызывает самостоятельную (оригинальную) оспу. Вирусы натуральной оспы коров и осповакцины имеют широкий спектр патогенности, включая крупный рогатый скот, буйволов, ло-ладей, ослов, мулов, верблюдов, кроликов, обезьян и человека.

ОСПА ВЕРБЛЮДОВ VARIOLA CAMELINA контагиозная болезнь, протекающая с образованием характерной узелково-пустулезной оспенной сыпи на коже и слизистых оболочках. Название оспы Variola произошло от латинского слова Varus, что означает кривой (рябой).

Эпизоотология болезни. К оспе восприимчивы верблюды всех возрастов, однако чаще и тяжелее болеет молодняк. В стационарных неблагополучных по оспе зонах взрослые верблюды болеют редко в связи с тем, что почти все переболевают оспой в молодом возрасте. У беременных верблюдиц оспа может вызывать аборты.

К оригинальному вирусу оспы верблюдов животные других видов в естественных условиях не восприимчивы. К вирусу же оспы коров и осповакцины, кроме коров и верблюдов, восприимчивы буйволы, лошади, ослы, свиньи, кролики и неиммунные к оспе люди. Из лабораторных животных к вирусам оспы коров и осповакцины чувствительны морские свинки после нанесения вируса на скарифицированную роговицу глаз (Ф. А. Петунии, 1958).

Основными источниками вирусов оспы являются больные оспой животные и люди, больные коровьей оспой и переболевающие в результате повышенной чувствительности после иммунизации их вирусом осповакцины оспенным детритом телят. Больные животные и люди рассеивают вирус во внешней среде в основном с отторгаемым эпителием кожи и слизистой оболочки, содержащими вирус. Во внешнюю среду вирус выделяется и с абортированными плодами (К. Н. Бучнев и Р. Г. Садыков, 1967). Возбудителя оспы могут механически разносить и невосприимчивые к оспе домашние и дикие животные, в том числе и птица, а также иммунные к оспе люди от прививаемых осповакциной детей.

В естественных условиях здоровые верблюды заражаются при контакте с больными животными на загрязненной вирусом территории через инфицированные воду, корма, помещения и предметы ухода, а также аэрогенно при разбрызгивании вируссодержащих истечений больными животными. Чаще верблюды заражаются при попадании вируса в организм через кожу и слизистые оболочки, особенно при нарушении их целостности или при авитаминозе А.

В виде эпизоотии оспа у верблюдов протекает примерно через каждые 20-25 лет. В это время особенно тяжело болеет молодняк. В период же между эпизоотиями в стационарно неблагополучных по оспе зонах среди верблюдов оспа протекает в виде энзоотии и спорадических случаев, возникающих более или менее регулярно через каждые 3-6 лет, главным образом среди животныхв возрасте 2-4 лет. В таких случаях животные болеют сравнительно легко, особенно в теплое время года. В холодное время оспа протекает тяжелее, длительнее и сопровождается осложнениями, в особенности у молодняка. В небольших хозяйствах за 2-4 недели заболевают почти все восприимчивые верблюды. Надо учитывать, что вспышки оспы среди верблюдов могут быть вызваны как оригинальным вирусом оспы верблюдов, так и вирусом оспы коров, не создающими иммунитета друг против друга. Поэтому вспышки, вызванные разными вирусами оспы, могут следовать одна за другой или протекать одновременно.

Патогенез определяется выраженной эпителиотропностью возбудителя. Попав в организм животного, вирус размножается и проникает в кровь (вирусемия), лимфатические узлы, внутренние органы, в эпителиальный слой кожи и слизистых оболочек и вызывает в них образование специфических экзантем и энантем, степень выраженности которых зависит от реактивности организма и вирулентности вируса, путей его проникновения в организм и состояния эпителиального слоя. Оспины развиваются последовательно по стадиям: от розеолы с узелком до пустулы с корочкой и образованием рубца.

Симптоматика. Инкубационный период в зависимости от возраста верблюдов, свойств вируса и путей проникновения его в организм колеблется от 3 до 15 дней: у молодняка 4-7, у взрослых 6-15 дней. Верблюжата, полученные от неиммунных верблюдиц, могут заболевать через 2-5 дней после рождения. Наиболее короткий инкубационный период (2-3 дня) бывает у верблюдов после заражения их вирусом осповакцины.

В продромальном периоде у заболевших верблюдов температура тела повышается до 40-41°, появляются вялость и отказ от корма, конъюнктива и слизистые оболочки рта и носа гипереми-рованы. Однако эти признаки часто просматриваются, особенно в начале возникновения болезни в хозяйстве.

Течение оспы у верблюдов в зависимости от их возраста также разное: у молодняка, особенно у новорожденного, чаще-острое (до 9 дней); у взрослых - подострое и хроническое, иногда латентное, чаще у беременных верблюдиц. Наиболее характерная форма оспы у верблюдов - кожная с подострым течением болезни (рис. 1).

При подостром течении болезни изо рта и носа выделяется прозрачная, позже мутноватая серовато-грязноватого цвета слизь. Животные трясут головой, сопят и фыркают, выбрасывая вместе с вируссодержащей слизью и пораженный вирусом эпителий. Вскоре в области губ, ноздрей и век образуется отечность, иногда распространяющаяся на межчелюстную область, шею и даже на область подгрудка. Подчелюстные и нижнешейные лимфатические узлы увеличены. У животных снижается аппетит, они чаще и дольше, чем обычно, лежат и с большим трудом поднимаются. К этому времени на коже губ, носа и век, на слизистой рта и носа появляются красновато-серые пятнышки; под ними образуются плотные узелки, которые, увеличиваясь, превращаются в папулы серого цвета, а затем в пустулы размером с горошину и фасоль с западающим центром и валикообразным утолщением по краям.

Пустулы размягчаются, лопаются и из них выделяется липкая жидкость светло-серого цвета. Отечность головы к этому времени исчезает. Через 3-5 дней вскрывшиеся пустулы покрываются корками. Если они не травмируются грубыми кормами, то болезнь на этом и заканчивается. Снятые или отпавшие первичные корочки имеют обратную кратерообразную форму пустул. На месте оспин остаются рубцы. Все указанные поражения на коже образуются в течение 8-15 дней.

Оспины у больных верблюдов чаще появляются вначале на голове. В возрасте от одного года до четырех лет верблюды пере-болевают, как правило, легко. Поражения локализуются на коже головы, преимущественно в области губ и носа. У верблюдиц нередко поражается вымя. Через несколько дней после вскрытия первичных пустул в области головы оспенные поражения образуются на коже и других малошерстных участках тела (в областях подгрудка, подмышечных впадин, промежности и мошонки, вокруг анального отверстия, внутренней части предплечья и бедра), а у верблюдиц также и на слизистой оболочке влагалища. В это время у верблюдов обычно вновь повышается температура тела, иногда до 41,5°, а верблюдицы на последнем месяце беременности приносят недоношенных и слаборазвитых верблюжат, которые, как правило, вскоре погибают.

У некоторых животных мутнеет роговица глаз (бельмо), отчего на 5-10 дней наступает временная слепота на один глаз, а у верблюжат чаще на оба глаза. У верблюжат, заболевших вскоре после рождения, появляются поносы. В этом случае в течение 3-9 дней после заболевания они погибают.

При сравнительно доброкачественном подостром течении оспы и обычно после заражения вирусом осповакцины животные через 17-22 дня выздоравливают.

У взрослых верблюдов на слизистой оболочке ротовой полости вскрывающиеся пустулы часто сливаются и кровоточат, особенно при травмировании грубыми кормами. Это затрудняет прием корма, животные худеют, процесс заживления затягивается до 30-40 дней, и болезнь принимает хроническое течение.

При генерализации оспенного процесса иногда развиваются пиемия и осложнения (пневмонии, гастроэнтериты, некробактери-оз и др.)- В таких случаях болезнь затягивается до 45 дней и дольше. Отмечаются случаи расстройства функций желудка и кишечника, сопровождающиеся атонией и запорами. У некоторых больных животных отмечают отек конечностей.

У верблюдиц при латентном течении оспы (без характерных клинических признаков болезни, лишь при наличии лихорадки) за 1-2 месяца до выжеребки происходят аборты (до 17-20%).

Прогноз болезни у взрослых верблюдов благоприятный , у верблюжат при остром течении, особенно в возрасте до 15-20 дней и у родившихся от неиммунных к оспе верблюдиц, неблагоприятный. Верблюжата болеют тяжело и до 30-90% их погибает. Верблюды в возрасте 1-3 лет переболевают оспой легче, а в старшем возрасте хотя и болеют тяжело, с признаками ярко выраженного генерализованного процесса, но процент смертности невелик (4-7%).

Патологоанатомические изменения характеризуются описанными выше поражениями кожи, слизистой оболочки и роговицы глаз. На эпикарде и слизистой кишок отмечаются точечные кровоизлияния. В грудной полости на костальной плевре иногда тоже видны мелкие кровоизлияния и узелки размером от просяного зерна до чечевицы серого и серо-красного цвета с творожистым содержимым. Слизистая оболочка пищевода покрыта узелками с просяное зерно, окруженными валикообразными возвышениями. Слизистая оболочка рубца (иногда и мочевого пузыря) имеет аналогичные кровоизлияния и узелки с неровными краями, а также мелкие язвочки с впавшим центром розоватого цвета. В папулах могут быть обнаружены элементарные тельца типа телец Пашена, имеющих диагностическое значение при микроскопии мазка-препарата под иммерсией через обычный световой микроскоп.

Диагноз базируется на анализе клинико-эпизоотических данных (при этом необходимо учитывать возможность заражения верблюдов от людей), патологоанатомических изменений, положительных результатов микроскопии (при обработке мазков из свежих папул методом серебрения по Морозову) или электронноско-пии, а также биопробы на восприимчивых к оспе животных. Удается выделить вирус из органов абортированных плодов больных оспой верблюдиц. При диагностировании оспы рекомендуется пользоваться также реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле и реакцией нейтрализации при наличии активных специфических сывороток или глобулинов.

Дифференциальный диагноз проводят в сомнительных случаях (с учетом клинико-эпизоотических особенностей). Оспу нужно отдифференцировать от некробактериоза микроскопией мазков из патологического материала и заражением восприимчивых к нему белых мышей; от ящура-заражением морских свинок суспензией патологического материала в плантарную поверхность кожи задних лап; от грибковых поражений и чесотки - нахождением соответствующих возбудителей в исследуемых со-скобах, взятых с пораженных участков кожи; от бруцеллеза при абортах, выкидышах и преждевременных выжеребках - исследованием сыворотки крови верблюдиц РА и РСК и бактериологическим исследованием плодов с выделением микробной культуры на питательных средах и микроскопией (при необходимости используют биопробу на морских свинках с последующими бактериологическими и серологическими исследованиями крови и сывороток).

При диагностировании оспы у верблюдов необходимо исключить также незаразную, но иногда принимающую массовое распространение болезнь, протекающую с поражением кожи в области губ и носа - янтак-баш (туркм.), джантак-бас (казахск.), которая возникает от травмирования их при поедании кустарников, названных верблюжьей колючкой (янтак, джантак, Alhagi) . Эту болезнь можно наблюдать обычно осенью у молодых верблюдов, преимущественно в возрасте до одного года. Взрослые верблюды поражаются верблюжьей колючкой несильно. При янтак-баше ни узелков, ни папулообразных поражений в отличие от оспы на слизистой оболочке рта, как правило, не бывает. Появляющийся же сероватый налет при янтак-баше сравнительно легко снимается. Однако надо учитывать, что янтак-баш способствует заболеванию верблюдов оспой, а нередко протекает одновременно с ней.

При выделении вируса оспы необходимо определить его вид (оригинальный, оспы коров или осповакцины), пользуясь при этом методами, указанными в инструкции Минздрава СССР 1968 г. По профилактике заболевания людей коровьей оспой, данными, полученными после заражения (в изолированных условиях) переболевших оспой верблюдов вирусом осповакцины и выделенными возбудителем болезни.

Лечение больных верблюдов в основном симптоматическое. Пораженные места обрабатывают раствором калия перманганата (1:3000), а после подсушивания смазывают смесью 10%-ной настойки йода с глицерином (1:2 или 1:3). После вскрытия оспины обрабатывают 5%-ной эмульсией синтомицина на витаминизированном рыбьем жире, к которой добавлена настойка йода в соотношении 1:15-1:20; мазями - цинковой, ихтиоловой, пеницил-линовой и др. Можно применять 2%-ные салициловую или борную мази и 20-30%-ную прополисовую мазь на вазелине. В жаркое время показаны 3%-ная креолиновая мазь, деготь и дуст гексахлорана. Пораженные участки 2-3 раза в день смазывают смоченными в эмульсиях и мазях тампонами.

Пораженную слизистую оболочку ротовой полости промывают 2 -3 раза в день 10%-ным раствором калия перманганата или 3%-ным раствором перекиси водорода или отварами шалфея, ромашки и другими дезинфицирующими и вяжущими средствами. При конъюнктивитах глаза промывают 0,1%-ным раствором сернокислого цинка.

Чтобы предупредить развитие вторичной микробной инфекции и возможные осложнения, рекомендуется внутримышечно вводить пенициллин и стрептомицин. При общей слабости и осложнениях показаны сердечные средства.

Из специфических средств лечения в тяжелых случаях болезни можно использовать сыворотку или кровь переболевших оспой верблюдов (подкожно из расчета 1-2 мл на 1 кг веса животного). Места инъекций предварительно тщательно выстригают и протирают настойкой йода.

Больным и выздоравливающим верблюдам часто дают чистую воду, болтушку из отрубей или ячменной муки, мягкое мятлико-вое или мелкое люцерновое сено или хлопковую шелуху, сдобренную ячменной мукой. В холодное время больных животных, особенно верблюжат, содержат в чистом, сухом и теплом помещении или покрывают попоной.

Иммунитет у естественно переболевших оспой верблюдов сохраняется до 20-25 лет, т. е. почти пожизненно. Характер иммунитета кожно-гуморальный, о чем свидетельствует присутствие в сыворотке крови переболевших животных вируснейтрализующих антител и невосприимчивость верблюдов к повторному заражению гомологичным вирусом оспы. Верблюжата, родившиеся от переболевших оспой верблюдиц, не восприимчивы к тому виду оспы, которым переболела верблюдица, особенно в первые три года, т. е. до половозрелого возраста. Верблюжата, находящиеся в период эпизоотии под маткой, как правило, оспой не заболевают или пере-болевают сравнительно легко и кратковременно.

Профилактика и меры борьбы заключаются в строгом соблюдении всех ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, своевременной диагностике болезни и определении вида вируса. Нельзя допускать к уходу за верблюдами лиц во время вакцинации и в поствакцинальный период до полного окончания у них (или у их детей) клинически выраженной на прививную оспу реакции. Всех поступающих в хозяйство верблюдов, коров и лошадей надо выдерживать в изоляторе в течение 30 дней.

При появлении оспы среди верблюдов, коров и лошадей специальным решением райисполкома местность, населенный пункт или район, пастбище, где обнаружена эта болезнь, объявляют неблагополучными по оспе и проводят карантинпо-ограннчительные и оздоровительные мероприятия.

О появлении оспы тотчас же сообщают вышестоящим ветеринарным организациям, соседним хозяйствам и районам для принятия надлежащих мер по недопущению дальнейшего распространения болезни.

Чтобы предупредить заражение верблюдов оспой коров, в неблагополучных и угрожаемых по оспе коров хозяйствах рекомендуется использовать медицинский препарат - оспенный детрит, которым иммунизируют всех клинически здоровых верблюдов независимо от их возраста, пола и физиологического состояния (беременность и кормящие верблюдицы). Для этого в нижней трети шеи верблюда выстригают шерсть, обрабатывают спирт-эфиром или 0,5%-ным раствором карболовой кислоты, досуха вытирают ватой или просушивают, скарифицируют кожу и наносят толстой иглой, концом скальпеля или скарификатором 2-3 неглубокие параллельные царапины Длиной 2-4 см. На свежескарифицирован-ную поверхность кожи наносят 3-4 капли растворенной вакцины и слегка втирают ее шпателем. Растворяют вакцину, как указано на этикетках ампул и коробок с ампулами. Разведенную и неиспользованную вакцину и ампулы из-под вакцины обеззараживают кипячением и уничтожают. Инструментарий, использованный для прививок, промывают 3%-ным раствором карболовой кислоты или 1%-ным раствором формальдегида и стерилизуют кипячением.

Если верблюд был неиммунным к оспе коров, то на 5-7-й день после вакцинации на месте скарификации должны появиться папулы. Если их нет, прививку повторяют, но с противоположной стороны шеи и вакциной другой серии. К уходу за иммунизированными и больными верблюдами допускают лиц, иммунных против оспы и ознакомленных с правилами личной гигиены. Молодняк, особенно из группы слабых, иногда может сильно реагировать на вакцинацию и переболевать с ярковыраженными признаками оспы.

Больных и сильно реагирующих на вакцину верблюдов изолируют и лечат (см. выше.). Животноводческие помещения и места, загрязненные вирусом оспы, рекомендуется дезинфицировать горячими 2-4%-ными растворами едкого натра и едкого кали, 3%-ным раствором серно-карболовой смеси или 2-3%-ными растворами серной кислоты или осветленными растворами хлорной извести, содержащими 2-6% активного хлора, которые инак-тивируют вирус оспы в течение 2-3 часов (О. Трабаев, 1970). Можно применять также 3-5%-ные растворы хлорамина и 2%-ный раствор формальдегида. Навоз нужно сжигать или обеззараживать биотермическим способом. Трупы верблюдов, павших с клиническими признаками оспы, необходимо сжигать. Молоко от больных и подозреваемых в заболевании оспой верблюдиц, если оно не содержит примеси гноя и не противопоказано по каким-либо другим признакам, можно употреблять в пищу только после кипячения в течение 5 минут или пастеризации при 85°-30 минут. Шерсть и шкуру от верблюдов, убитых в период неблагополучия хозяйства по оспе, обрабатывают согласно наставлению по дезинфекции сырья животного происхождения.

Ограничения с хозяйств и населенных пунктов, неблагополучных по оспе, рекомендуется снимать не ранее чем через 20 суток после выздоровления всех больных оспой животных и людей и тщательно проведенной заключительной дезинфекции.

134. Химический состав и биохимические свойства вирусов

1.1Строение и химический состав вирионов.

Самые крупные вирусы (вирусы оспы) приближаются по размерам к небольшим размерам бактерий, самые мелкие (возбудители энцефалита, полиомиелита, ящура)к крупным белковым молекулам, направленных к молекулам гемоглобина крови. Иными словами, среди вирусов есть свои великаны и карлики. Для измерения вирусов используют условную величину, называемую нанометром (я1нм). Один нм составляет миллионную долю миллиметра. Размеры разных вирусов варьируют от 20 до нескольких сотеня1 нм.

Простые вирусы состоят из белка и нуклеиновый кислоты. Наиболее важная часть вирусной частицы нуклеиновая кислота является носителем генетической информации. Если клетки человека, животных, растений и бактерий всегда содержат два типа нуклеиновых кислот дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК и рибонуклеиновую РНК, то у разных вирусов обнаружен лишь один тип или ДНК, или РНК, что положено в основу их классификации. Второй обязательный компонент вириона белки отличаются у разных вирусов, что позволяет распознавать их с помощью иммунологических реакций.

Более сложные по структуре вирусы, кроме белков и нуклеиновых кислот, содержат углеводы, липиды. Для каждой группы вирусов характерен свой набор белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Некоторые вирусы содержат в своём составе ферменты. Каждый компонент вирионов имеет определённые функции: белковая оболочка защищает их от неблагоприятных воздействий, нуклеиновая кислота отвечает за наследственные и инфекционные свойства и играет ведущую роль в изменчивости вирусов, а ферменты участвуют в их размножении. Обычно нуклеиновая кислота находится в центре вириона и окружена белковой оболочкой (капсидом), как бы одета в неё.

Капсид состоит из определённым образом уложенных однотипных белковых молекул (капсомеров), которые образуют симметричные геометрические формы в месте с нуклеиновой кислотой вирусы (нуклеокапсид). В случае кубической симметрии нуклеокапсида нить нуклеиновой кислоты свёрнута в клубок, а капсомеры плотно уложены вокруг неё. Так устроены вирусы полиомиелита, ящура и др.

При спиральной (палочковидной) симметрии нуклеокапсида нить вируса закручена в виде спирали, каждый её виток покрыт капсомерами, темно прилегающими друг к другу. Структуру капсомеров и внешний вид вирионов можно наблюдать с помощью электронной микроскопии.

Большая часть вирусов, вызывающих инфекции у человека и животных, имеет кубический тип симметрии. Капсид почти всегда имеет форму икосаэдра правильного двадцатигранника с двенадцатью вершинами и с гранями из равносторонних треугольников.

Многие вирусы помимо белкового капсида имеют внешнюю оболочку. Кроме вирусных белков и гликопротеинов она содержит ещё и липиды, позаимствованные у плазматической мембраны клетки хозяина. Вирус гриппа пример спирального вириона в оболочке с кубическим типом симметрии.

Современная классификация вирусов основана на виде и формы их нуклеиновой кислоты, типе симметрии и наличии или отсутствие внешней оболочки.

Биохимические свойства-см. методичку!!!

135. Кусочки органов, сохраняющие функциональную и пролифилирующую активность in vitro

Культура клеток

клетки какой-либо ткани животных, способные расти в виде монослоя в искусственных условиях на стеклянной или пластмассовой поверхности, залитой специальной питательной средой. Источником к-ры клеток являются свежеполученные животные ткани - первичные к-ры клеток", лабораторные штаммы клеток- перевиваемые к-ры. клеток. Лучшей способностью к росту в искусственных условиях обладают эмбриональные и опухолевые клетки. Диплоидная к-ра клеток человека и обезьян пассируется ограниченное число раз, поэтому ее иногда называют полуперевиваемой к-рой клеток. Этапы получения к-ры клеток: измельчение источника; обработка трипсином; освобождение от детрита; стандартизация числа клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками; разлив в пробирки или флаконы, в к-рых клетки оседают на стенки или дно, и приступают к размножению; контроль за образованием монослоя. К-ры клеток применяют для выделения вируса из иссл. материала, для накопления вирусной суспензии, изучения св-в. В последнее время ее стали применять в бактериологии.

136. Парастезии. Что это такое?

ПАРЕСТЕЗИИ (от греч. para-около, вопреки и aisthesis-ощущение), называемое иногда также дизестезиями, не обусловленные внешним раздражением ощущения онемения, покалывания,бегания мурашек (myrmecia- sis, myrmecismus, formicatio), жжения, зуда, болезненного холода (т. н. психроэстезия), движения и т. д., ощущения в кажущихся сохраненными конечностях у ампутированных (pseudomelia paraesthetica). Причины возникновения П. могут быть различны. П. могут возникать вследствие местных изменений кровообращения, при болезни Рено, при эритромелальгии, при акропарестёзии, при эндартериитах, как начальный симптом спонтанной гангрены. Иногда же Они возникают при поражении нервной системы, при травматических невритах (ср. типические. П. при ушибе п. ulnaris в области sulcus olecrani), при токсических и инфекционных невритах, при радикулитах, при спинальных пахиме-нингитах (сдавление корешков), при острых и хрон. миелитах, особенно же при едавле-ниях спинного мозга (опухоли спинного мозга) и при tabes dorsalis. Диагностическое значение их во всех этих случаях такое же, как и диагностическое значение болей, анестезий и гиперестезии: появляясь в определенных территориях, по тракту того или иного периферического нерва или в области той или иной корешковой иннервации, они могут дать ценные указания на место локализации пат. процесса. П. возможны и как проявления церебрального повреждения. Так, при кортикальной эпилепсии припадки часто начинаются П., локализующимися в той конечности, с которой начинаются затем судороги. Нередко они наблюдаются и при церебральном артериосклерозе или при церебральном сифилисе и иногда являются предвестниками апоплектического инсульта.- Обособленное положение занимают т. н. психические П., т. е. П. психогенного, ипохондрического происхождения, для которых характерно особенно то, что они имеют не элементарный, как органические, а сложный характер-«ползания червей под кожей головы», «поднимания шара из живота к шее» (Oppenheim) и т. д. Их диагностическое значение разумеется совершенно иное, чем органических П

137. Правила работы и техника безопасности с вирусосодержащим материалом

138. Вирус инфекционного ринотрахеита КРС

Инфекционный ринотрахеит (лат. - Rhinotracheitis infectiosa bovum; англ. - Infectious bovine rhinotracheites; ИРТ, пузырьковая сыпь, инфекционный вульвовагинит, инфекционный ринит, «красный нос», инфекционный катар верхних дыхательных путей) - остро протекающая контагиозная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся преимущественно катарально-некротическими поражениями дыхательных путей, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также пустулезным вульвовагинитом и абортами.

Возбудитель ИРТ - Herpesvirus bovis 1, относится к семейству герпесвирусов, ДНК-содержащий, диаметр вириона 120... 140 нм. Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков данного вируса.

Вирус ИРТ легко культивируется в ряде культур клеток, вызывая ЦПД. Репродукция вируса сопровождается подавлением митотического деления клеток и образованием внутриядерных включений. Он также обладает гемагглютинирующими свойствами и тропизмом к клеткам органов дыхания и размножения и может мигрировать со слизистых оболочек в центральную нервную систему, способен заражать плод в конце первой и во второй половине беременности.

При - 60...-70 "С вирус выживает 7...9мес, при 56 °С инактивируется через 20 мин, при 37 °С -через 4...10сут, при 22 °С -через 50сут. При 4 "С активность вируса уменьшается незначительно. Замораживание и оттаивание снижают его вирулентность и иммуногенную активность.

Растворы формалина 1: 500 инактивируют вирус через 24 ч, 1: 4000 - через 46 ч, 1: 5000 - через 96 ч. В кислой среде вирус быстро теряет активность, длительно (до 9 мес) сохраняется при рН 6,0...9,0 и температуре 4 °С. Имеются сведения о выживаемости вируса в сперме быков, хранящейся при температуре сухого льда, в течение 4... 12 мес, а в жидком азоте - в течение 1 года. Показана возможность инактивирования вируса в сперме быков при обработке ее 0,3%-ным раствором трипсина.

Источники возбудителя инфекции - больные животные и латентные вирусоносители. После заражения вирулентным штаммом все животные становятся латентными носителями вируса. Очень опасны быки-производители, так как после переболевания они выделяют вирус в течение 6 мес и могут заражать коров при случке. Вирус выделяется во внешнюю среду с носовым секретом, истечениями из глаз и половых органов, с молоком, мочой, калом, спермой. Предполагают, что в странах Африки антилопы гну являются резервуаром вируса ИРТ. Помимо того вирус может реплицироваться в клещах, которые играют важную роль в возникновении заболевания среди крупного рогатого скота.

Факторами передачи вируса служат воздух, корма, сперма, транспортные средства, предметы ухода, птицы, насекомые, а также человек (работники фермы). Пути передачи - контактный, воздушно-капельный, трансмиссивный, алиментарный.

Восприимчивые животные - крупный рогатый скот независимо от пола и возраста. Наиболее тяжело болезнь протекает у скота мясных пород. В эксперименте удавалось заразить овец, коз, свиней, оленей. Обычно животные заболевают через 10... 15 сут после поступления в неблагополучное хозяйство.

Заболеваемость при ИРТ составляет 30...100 %, летальность - 1...15 %, может быть выше, если болезнь осложняется другими респираторными инфекциями.

В первичных очагах болезнь поражает почти все поголовье, при этом летальность достигает 18 %. ИРТ чаще возникает в хозяйствах промышленного типа при комплектовании групп животных, привезенных из разных хозяйств.

При попадании на слизистые оболочки дыхательных или половых путей вирус внедряется в клетки эпителия, где размножается, вызывая их гибель и слущивание. Затем на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей образуются язвы, а в половых путях - узелки и пустулы. Из первичных очагов поражения вирус с воздухом попадает в бронхи, а из верхних дыхательных путей может попасть в конъюнктиву, где вызывает дистрофические изменения в пораженных клетках, что провоцирует ответную воспалительную реакцию организма. Затем вирус адсорбируется на лейкоцитах и разносится по лимфатическим узлам, а оттуда попадает в кровь. Вирусемия сопровождается общим угнетением животного, лихорадкой. У телят вирус может кровью заноситься в паренхиматозные органы, где он размножается, вызывая дегенеративные изменения. При прохождении вируса через гематоэнцефалический и плацентарный барьеры патологические изменения появляются в мозге, плаценте, матке и плоде. Патологический процесс во многом также зависит от осложнений, вызванных микрофлорой.

Инкубационный период в среднем составляет 2...4 дня, очень редко больше. В основном болезнь протекает остро. Различают пять форм ИРТ: поражение верхних дыхательных путей, вагиниты, энцефалиты, конъюнктивиты и артриты.

При поражении респираторных органов возможна хроническая серозно-гнойная пневмония, при которой погибает около 20 % телят. При генитальной форме поражаются наружные половые органы, у коров иногда развиваются эндометриты, а у быков-производителей - орхиты, что может стать причиной бесплодия. У быков, используемых для искусственного осеменения, ИРТ проявляется рецидивирующим дерматитом в области промежности, ягодиц, вокруг ануса, иногда на хвосте, мошонке. Инфицированная вирусом сперма может стать причиной эндометритов и бесплодия коров.

Аборты и гибель плода в утробе матери отмечают через 3 нед после заражения, что совпадает с повышением титра антител в крови стельных коров-реконвалесцентов, присутствие которых не предупреждает аборты и смерть плода в утробе матери.

Отмечена склонность ИРТ к латентному течению при генитальной форме. В эпителии слизистой оболочки влагалища, его преддверии и вульве образуются многочисленные разной величины пустулы (пустулезный вульвовагинит). На их месте появляются эрозии и язвочки. После заживления язвенных поражений на слизистой оболочке долго остаются гиперемированные узелки. У больных быков процесс локализуется на препуции и половом члене. Характерно образование пустул и пузырьков. У незначительной части стельных коров возможны аборты, рассасывание плода или преждевременный отел. Абортировавшие животные, как правило, ранее переболевали ринотрахеитом или конъюнктивитом. Среди абортировавших коров не исключены летальные исходы из-за метритов и разложения плода. Однако нередки случаи абортов при отсутствии воспалительных процессов на слизистой оболочке матки коровы. При ИРТ встречаются случаи острого мастита. Вымя резко воспалено и увеличено, болезненно при пальпации. Резко снижаются надои.

При менингоэнцефалитах наряду с угнетением отмечают расстройство двигательных функций и нарушение равновесия. Болезнь сопровождается мышечным тремором, мычанием, скрежетом зубов, конвульсиями, слюнотечением. Такой формой болезни в основном заболевают телята 2...6-месячного возраста.

Респираторная форма инфекции характеризуется внезапным повышением температуры тела до 41...42 "С, гиперемией слизистой оболочки носа, носоглотки и трахеи, угнетением, сухим болезненным кашлем, обильным серозно-слизистым истечением из носа (ринит) и пенистым слюноотделением. По мере развития болезни слизь становится густой, в дыхательных путях образуются слизистые пробки и очаги некроза. При тяжелом течении болезни отмечают признаки асфиксии. Гиперемия распространяется на носовое зеркало («красный нос»). Доказана этиологическая роль вируса ИРТ при массовом кератоконъюнктивите молодняка крупного рогатого скота. У молодняка болезнь проявляется иногда в виде энцефалита. Начинается она внезапным возбуждением, буйством и агрессией, нарушением координации движений. Температура тела нормальная. У телят раннего возраста некоторые штаммы вируса ИРТ вызывают остро протекающее заболевание ЖКТ.

В целом у больных животных клинически четко выражена респираторная форма, генитальная форма часто протекает незаметно.

При вскрытии животных, убитых или павших при острой респираторной форме, обычно обнаруживают признаки серозного конъюнктивита, катарально-гнойного ринита, ларингита и трахеита, а также поражение слизистых оболочек придаточных полостей. Слизистая оболочка носовых раковин отечна и гиперемирована, покрыта слизисто-гнойными наложениями. Местами выявляют разной формы и величины эрозивные поражения. Гнойный экссудат скапливается в носовой и придаточных полостях. На слизистых оболочках гортани и трахеи точечные кровоизлияния и эрозии. В тяжелых случаях слизистая оболочка трахеи подвергается очаговому некрозу, у погибших животных возможна бронхопневмония. В легких встречаются очаговые участки ателектазов. Просветы альвеол и бронхов в пораженных областях заполнены серозно-гнойным экссудатом. Сильно выражен отек интерстициальной ткани. При поражении глаз конъюнктива века гиперемирована, с явлениями отека, который распространяется и на конъюнктиву глазного яблока. Конъюнктива покрыта саловидным налетом. Часто на ней образуются сосочкообразные бугорки размером около 2 мм, небольшие эрозии и язвочки.

При генитальной форме на сильно воспаленной слизистой оболочке влагалища и вульвы видны пустулы, эрозии и язвочки на разных стадиях развития. Кроме вульвовагинита можно обнаружить серозно-катаральный или гнойный цервицит, эндометрит и значительно реже проктит. У быков-производителей в тяжелых случаях к пустулезному баланопоститу присоединяются фимоз и парафимоз.

Свежие абортированные плоды обычно отечные, с незначительными аутолитическими явлениями. На слизистых и серозных оболочках небольшие кровоизлияния. По прошествии более длительного срока после гибели плода изменения носят более тяжелый характер; в межмышечной соединительной ткани и в полостях тела скапливается темно-красная жидкость, в паренхиматозных органах - очаги некроза.

При поражении вымени обнаруживают серозно-гнойный диффузный мастит. Поверхность разреза отечная, отчетливо гранулирована вследствие увеличения пораженных долек. При надавливании с нее стекает мутный гноеподобный секрет. Слизистая оболочка цистерны гиперемированная, набухшая, с кровоизлияниями. При энцефалитах в головном мозге выявляют гиперемию сосудов, отечность тканей и мелкие кровоизлияния.

ИРТ диагностируют на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений в органах и тканях с обязательным подтверждением лабораторными методами. Латентную инфекцию устанавливают только лабораторными исследованиями.

Лабораторная диагностика включает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в РН или РИФ; 2) обнаружение антигенов вируса ИРТ в патологическом материале при помощи РИФ; 3) выявление антигенов в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РН или РИГА.

Для вирусологического исследования от больных животных берут слизь из носовой полости, глаз, влагалища, препуция; от вынужденно убитых и павших - кусочки носовой перегородки, трахеи, легкого, печени, селезенки, мозга, региональных лимфатических узлов, взятых не позднее 2 ч после гибели. Также берут сыворотку крови для ретроспективной серологической диагностики. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов ИРТ крупного рогатого скота и набор эритроцитарного диагностикума для серодиагностики инфекции в РИГА.

Диагностику ИРТ проводят параллельно с исследованием материала на парагрипп-3, аденовирусную инфекцию, респираторно-синцитиальную инфекцию и вирусную диарею.

Предварительный диагноз на ИРТ крупного рогатого скота ставят на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале при помощи РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений. Окончательный диагноз устанавливают на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса.

При дифференциальной диагностике инфекционного ринотрахеита необходимо исключить ящур, злокачественную катаральную горячку, парагрипп-3, аденовирусную и хламидийную инфекции, вирусную диарею, респираторно-синцитиальную инфекцию, пастереллез.

Переболевание сопровождается стойким и длительным иммунитетом, который может передаваться потомству с антителами молозива. Иммунитет переболевших животных длится не менее 1,5...2 лет, однако даже выраженный гуморальный иммунитет не предотвращает персистенции вируса у животных-реконвалесцентов, и их следует рассматривать как потенциальный источник инфицирования других животных. Поэтому всех животных, имеющих антитела к ИРТ, следует считать носителями вируса, находящегося в состоянии латенции.

139. Резервуаром питательных веществ у развивающихся эмбрионов птиц является

Учитывая сложный и достаточно длительный процесс эмбриогенеза у птиц необходимо формирование специальных временных внезародышевых - провизорных органов. Первым из них образуются желточный мешок, а в последующем и остальные провизорные органы: амниотическая оболочка (амнион), серозная оболочка, аллантоис. В эволюции до этого желточный мешок встречался только у осетровых рыб, которые имеют резко телолецитальную клетку и процесс эмбриогенеза сложный и длительный. При формировании желточного мешка отмечается обрастание желтка частями листков, которые мы называем внезародышевыми листками или внезародышевым материалом. Но краю желтка его начинает обрастать внезародышевая энтодерма. Внезародышевая мезодерма расслаивается на 2 листка: висцеральный и париетальный, при этом висцеральный листок прилежит к внезародышевой энтодерме, а париетальный - к внезародышевой эктодерме.

Внезародышевая эктодерма отодвигает белок и также обрастает желток. Постепенно желточные массы полностью окружаются стенкой состоящей из внезародышевой энтодермы и висцерального листка внезародышевой мезодермы - образуется первый провизорный орган - желточный мешок.

Функции желточного мешка. Клетки энтодермы желточного мешка начинают выделять гидролитические ферменты, которые расщепляют желточные массы. Продукты расщепления всасываются и по кровеносным сосудам поступают к зародышу. Так желточный мешок обеспечивает трофическую функцию. Из висцеральной мезодермы образуются первые кровеносные сосуды и первые клетки крови и, следовательно, желточный мешок выполняет также кроветворную функцию. У птиц и млекопитающих среди клеток желточного мешка рано обнаруживается клетки полового зачатка - гонобласта.

140. Реактивация. Что это такое?

По изменению генотипа мутации подразделяют на точечные (локализующиеся в индивидуальных генах) и генные (затрагивающие более обширные участки генома).
Заражение вирусами чувствительных клеток носит множественный характер, т.е. в клетку проникает сразу несколько вирионов. При этом вирусные геномы в процессе репликации могут кооперироваться или интерферировать. Кооперативные взаимодействия между вирусами представлены генетическими рекомбинациями, генетической реактивацией, комплементацией и фенотипическим смешиванием.
Генетическая рекомбинация чаще встречается у ДНК-содержащих вирусов или РНК-содержащих вирусов с фрагментированным геномом (вирус гриппа). При генетической рекомбинации происходит обмен между гомологичными участками вирусных геномов.
Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов с мутациями в разных генах. При перераспределении генетического материала формируется полноценный геном.
Комплементация происходит когда один из вирусов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезирует нефункциональный белок. Немутантный вирус, синтезируя полноценный белок, восполняет отсутствие его у мутантного вируса.

Клеточные культуры

Технология клеточных культур заключается в выращивании клеток вне живых организмов.

Культуры растительных клеток

Культуры растительных клеток не только являются важным этапом создания трансгенных растений, но и экологически приемлемым и экономически оправданым источником природных продуктов, обладающих терапевтическими свойствами, как, например, паклитаксель (paclitaxel), содержащийся в тисовой древесине и выпускаемый как препарат для химиотерапии под названием Таксол (Taxol). Культуры растительных клеток также применяются для производства веществ, используемых пищевой промышленностью в качестве ароматизаторов и красителей.

Культуры клеток насекомых

Изучение и применение культур клеток насекомых расширяет возможности разработки и использования человеком биологических агентов, уничтожающих насекомых-вредителей, но не влияющих на жизнеспособность полезных насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Несмотря на то, что достоинства биологических методов борьбы с вредителями были известны уже давно, производство таких биологически активных веществ и патогенных для насекомых и микроорганизмов в промышленных количествах очень затруднено. Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Эта перспектива в настоящее время активно изучается. Кроме того, изучается возможность использования клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вирусоподобные частицы) для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.

Культуры клеток млекопитающих

Клеточные культуры млекопитающих являются одним из главных инструментов, используемых специалистами племенного животноводства в течение уже не одного десятилетия. В лабораторных условиях яйцеклетки, полученные от коров, обладающих выдающимися качествами, оплодотворяются сперматозоидами соответствующих быков. Образующиеся при этом эмбрионы в течение нескольких дней выращиваются в пробирке, после чего имплантируются в матки суррогатных коров-матерей. Этот же прием является основой экстракорпорального оплодотворения человека.

В настоящее время использование культур клеток млекопитающих выходит далеко за рамки искусственного оплодотворения. Клетки млекопитающих могут дополнять, а возможно, когда-нибудь и заменят использование животных для тестирования безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме того, так же как клетки растений и насекомых, клетки млекопитающих могут быть использованы для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Например, моноклональные антитела синтезируются именно культурами клеток млекопитающих.

Ученые также рассматривают возможность использования клеток млекопитающих для производства вакцин. В 2005 году Министерство здравоохранения и социальных услуг США заключило с компанией Sanofi Pasteur контракт на 97 миллионов долларов США. Задачей специалистов компании является разработка методик культивирования клеток млекопитающих с целью ускорения процесса разработки вакцин против гриппа и, соответственно, повышения готовности человечества к пандемии.

Методы терапии, основанные на использовании культур взрослых стволовых клеток , обнаруженных в некоторых тканях организма (костном мозге, жировой ткани, мозге и др.), также скоро займут достойное место в клинической практике. Исследователи установили, что стволовые клетки могут быть использованы организмом для восстановления поврежденных тканей. Взрослые гемопоэтические стволовые клетки уже давно используются в качестве трансплантатов костного мозга. Они необходимы для восстановления процессов созревания и формирования всех типов клеток крови. Такие клетки могут быть в больших количествах получены из пуповинной крови, однако их выделение является довольно сложным процессом.

В настоящее время исследователи работают над методами выделения стволовых клеток из плаценты и жировой ткани. Ряд специалистов занят разработкой методов клеточного ре-программирования – возвращения в недифференцированное состояние зрелых клеток организма, например, клеток кожи, и последующей стимуляции их дифференцирования в клетки необходимого типа ткани.

Эмбриональные стволовые клетки

Использование эмбриональных стволовых клеток также рассматривается в качестве потенциального метода терапии многих заболеваний. Как понятно из названия, эмбриональные клетки получают из эмбрионов, в частности, тех, что развиваются из яйцеклеток, оплодотворенных in vitro (в клиниках, занимающихся экстракорпоральным оплодотворением) и, с согласия доноров, переданных исследователям для использования в научных целях. Обычно используются бластоцисты – 4-5-дневные эмбрионы, выглядящие под микроскопом как шарики, состоящие из нескольких сотен клеток.

Для выделения человеческих эмбриональных стволовых клеток внутренняя клеточная масса бластоцисты переносится в богатую питательными веществами культуральную среду, где клетки начинают активно делиться. В течение нескольких дней клетки покрывают всю поверхность культуральной плашки. После этого исследователи собирают делящиеся клетки, делят их на части и помещают в новые плашки. Процесс перемещения клеток в новые плашки называется пересевом и может многократно повторяться в течение многих месяцев. Цикл пересева клеток называется пассаж . Эмбриональные стволовые клетки, просуществовавшие в культуре в течение шести и более месяцев без дифференцировки (т.е. остающиеся плюрипотентными – способными дифференцироваться в клетки любой ткани организма) и сохранившие нормальный набор генов, называются линией эмбриональных стволовых клеток .

Внутренняя поверхность культуральной плашки зачастую покрывается клетками кожи мышиных зародышей, генетически модифицированных на неспособность к делению. Эти клетки образуют фидерный слой – «питательную подложку», благодаря которой эмбриональные клетки прикрепляются к поверхности. Ученые пытаются усовершенствовать существующий метод и исключить необходимость использования мышиных клеток, так как их присутствие всегда привносит риск попадания в культуру человеческих клеток вирусных частиц и мышиных белков, способных вызвать аллергическую реакцию.

Максимальная ценность терапии с использованием стволовых клеток и тканевой инженерии может быть достигнута в том случае, если терапевтические стволовые клетки и ткани, выращенные из них, являются генетически идентичными клеткам реципиента. Поэтому, если сам пациент не является их источником, стволовые клетки должны быть модифицированы методом замещения их генетического материала генами реципиента и только потом дифференцированы в клетки специфического типа. На настоящее время процедура замещения генетического материала и ре-программирования может быть успешно проделана только с эмбриональными стволовыми клетками.

Тема 10. Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток

Контрольные вопросы

Задание к следующему занятию.

Подведение итогов занятия.

Задания

1. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.

2. Заразить куриные эмбрионы вирусами ньюкаелской болезни и оспы голубей (кур).

3. Вскрыть зараженные куриные эмбрионы, получить ХАО и аллантоисную жидкость.

4. Поставить капельную РГА с аллантоисной жидкостью.

Самостоятельная работа студентов:

а) подготовка рабочих мест и спецодежды к вскрытию куриных эмбрионов, зараженных на предыдущем занятии;

б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА;

в) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, извлечение ХАО, подсчет и зарисовка оспин;

г) подготовка к обеззараживанию инструментов, эмбрионов, посуды.

1. Что вы знаете о методах индикации вирусов в куриных эмбрионах?

2. Какие способы получения вируссодержащего материала от куриных эмбрионов вы знаете?

3. Каковы гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование? Каков механизм гемагглютинации?

Цель занятия: изучить различные виды культур, их номенклатуру. Изучить материальное обеспечение при производстве клеточных культур.

Оборудование и материалы: растворы Хенкса. Эрла, питательная среда 199, Игла, гидролизат лактальбумина, матрасы, флаконы, стеклянная посуда, готовые культуры клеток, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя. Выращивание культур клеток для получения различных биологических про­дуктов, проведения научно-исследовательских или диагностических работ явля­ется революционизирующим моментом XX в. Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX в. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил вто­рой этап работ – выращивание клеток и репродукция в них вирусов. Третий и четвертый этапы начинаются с появлением возможности вставить в клетки экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и подтверждения возмож­ности выращивания из одиночной клетки целой популяции (гибридом что знаменуют собой возможность получения трансгенных систем и клонирования организмов. В настоящее время ни одна вирусологическая лаборатория не может обойтись без культуры клеток. Культуры клеток имеют следующие преимущества перед лабораторными животными и куриными эмбрионами:

можно добиться заражения практически всех культур клеток, что позволяет получать вируссодержащий материал с наивысшей концентрацией вируса при наименьшем содержании белкового балласта;

поскольку можно получить культуры клеток любого вида животного, снимаются видовые ограничения культивирования вирусов;

возможно вмешательство в инфекционный процесс в любой момент, не нарушая целостности живой системы;

можно непрерывно контролировать ход инфекционного процесса;

возможно получение готовой суспензии вируса в виде культуральной жидкости;

соблюдается полная стерильность культуральном жидкости в отношении грибов и бактерий;

предельно просты техника заражения и получение вируссодержащего материала;

относительная дешевизна.

Культуры клеток – наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаще всего используют для первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала, накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории, титрования вирусов и как тест-объект в реакции нейтрализации.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования:

используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу. Чувствительность ее повышается, если клетки получены от молодых животных (лучше эмбрионов);

10.1 Типы культур клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 26). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Рисунок 26. Первичная культура клеток легких эмбриона овцы (по Троценко Н.И. и др.)

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой.

Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8–10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо отпроисхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg ++ , Ca ++), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5-–10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

Диплоидные культуры клеток. Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотр. показали способность клеток размножаться в свободно суспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии – применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях (рис. 27) в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).

Рисунок 27. Культивирование клеток на микроносителях (схема)

10.2 Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур – первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток – хранение их при 4 °С до 1–6 нед. Успешно применяют хранение клеточных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 10 6 в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10–40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применяют ДМСО – диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1–3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хранения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азот е в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1–2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80–90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7–8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды.

10.3 Контаминация культур клеток. Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических и других исследованиях, в биотехнологии требуют постоянного контроля на отсутствие посторонних агентов (контаминантов). Контаминантами могут быть вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и клетки других клеточных культур. Микоплазмы – одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное выявление их, других микроорганизмов или вирусов в культуре клеток – важное условие поддержания высокого качества последней. Паспортизация стабильных клеточных линий предусматривает в качестве необходимого теста контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации, что должно стать обязательным для всех лабораторий, где работают с культурами клеток.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следующие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитологические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти препараты следует строго дозировать и применять дифференцированно. Их использование – необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах, характер действия которых приведен в таблице 5. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.

Таблица 5.

Противомикробные препараты для культур клеток (Л. П. Дьяконов и др.)

Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro - вне организма, в отличие от in vivo - в организме), образуя культуру клеток. Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов периферической крови. Изучение поведения клеток в культуре помогает понять механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с другом. Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления прекратятся. Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки, претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже на новой среде. Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз, чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по имени открывшего его ученого феноменом Хейфлика , многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на клеточном уровне. Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное число делений. Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными: синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности, например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными. Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки. Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях. Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ. Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии - для выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и хромосомы вновь синтезированных химических веществ.

1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс , Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa .

Основные принципы культивирования [ | ]

Выделение клеток [ | ]

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток [ | ]

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Перекрёстное загрязнение клеточных линий [ | ]

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток [ | ]

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, ирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия .

Гибридома [ | ]

Использование клеточных культур [ | ]

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии .

Продукты биотехнологии [ | ]

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины , противоопухолевые препараты . Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры [ | ]

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .

Вакцины [ | ]

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого штаммом вируса H5N1 , в настоящий момент правительство Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих [ | ]

Культуры клеток растений [ | ]

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .

Бактериальные, дрожжевые культуры [ | ]

Основная статья:

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры [ | ]