Реакции в иммунологии. Иммунодиагностические реакции

В основу реакций иммунитета положено специфическое взаимодействие антигена с антителом. С помощью известных антигенов можно определить наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого лица (серологическая диагностика инфекционных заболеваний). И, наоборот, наличие специфических иммунных сывороток позволяет установить родовую, видовую и типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Агглютинация – склеивание микробов или других клеток при воздействии на них иммунной сыворотки, содержащей антитела – агглютинины. Реакция агглютинации проявляется в том, что равномерной взвеси клеток, например бактерий, при добавлении иммунной сыворотки происходит скручивание клеток, образование зернышек или хлопьев, которые постепенно оседают на дно, жидкость же над осадком совершенно просветляется. Однако зернышки или хлопья образуются только в том случае, если реакция происходит в присутствии электролитов. Таким образом, для проявления реакции агглютинации нужно иметь: 1) антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток; 2)антитела (агглютинины) в виде иммунной сыворотки; 3) электролиты (физиологический раствор).

Внешнее проявление положительной реакции агглютинации бактерий имеет двоякий характер в зависимости от свойств антигена: у безжгутиковых бактерий, имеющих только один соматический или О-антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток, и образующиеся кучки имеют вид мелких компактных зерен. Такая агглютинация называется тонкозернистой; она происходит медленно – в течение 18-22 часов. У бактерий со жгутиками имеются два антигена – соматический, О-антиген, в самой клетке и жгутиковый, Н-антиген, находящийся в жгутиках. Клетки склеиваются друг с другом жгутиками и образуют рыхлые крупные хлопья. Такая агглютинация называется крупнохлопчатой; она наступает быстро – в течение 2-4 часов.

Реакция аггютнации благодаря своей специфичности, простоте и постановке и демонстративности получила широкое распространение в микробиологической практике для диагноза многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа, сыпного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, бруцеллеза и др. Ею пользуются с диагностической целью в 2 направлений.

1. Для определения выделения выделенного из какого-либо субстрата неизвестного микроба. В этом случае агглютинацию ставят с определенной, заранее приготовленной агглютинирующей сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов определенным видом бактерий и, следовательно, содержащей агглютинины в отношении этих бактерий.

В качестве антигена берут культуру неизвестного исследуемого микроба. Положительный результат реакции указывает, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления агглютинирующей сыворотки.

2. Для обнаружения агглютининов к тому или другому определенному виду бактерий в сыворотке больного. В этом случае для агглютинации берут определенную лабораторную культуру бактерий (или несколько культур бактерий разных видов) в качестве в качестве антигена и сыворотку больного. Положительный результат агглютинации указывает на то, что сыворотке больного имеются агглютинины к определенному, известному, виду микроба, т.е. данный микроб является возбудителем заболевания, в процессе которого в сыворотке больного накопились защитные антитела.

Механизм: «теория решетки».

Активный центр АТ соединяется с 1 антигенной детерминантой, 2-ой активный центр реагирует с антигенной детерминантой, находящейся на 2 молекуле АГ, в результате происходит склеивание. Если в качестве АТ взята безжгутиковая бактерия, то зернистость мелкая – агглютинация., если жгутиковая – Н-агглютинация (крупная зернистость).

Варианты агглютинации:

1. Ориентировочная на стекле – для выявления серологических свойств бактерий, для выявления признаков, для идентификации.

2. Развернутая в пробирках – мало чувствительна и невысоко специфична. Определяется титр АТ (это максимальное разведение сыворотки, в которой обнаружена агглютинация).

3. РНГА (нагрузочная реакция) – реакция непрерывной Геной агглютинации – используется АГ, абсорбированный на эритроцитах барана, т.о. перевод из растворимого в корпускулярный – агглютинация эритроцитов.

Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовится путем иммунизации кроликов.

Сыворотка от больного для постановки реакции агглютинации получается из его крови, взятой стерильно на локтевой вене в количестве 5-10 мл. одновременно часть крови употребляется для посева. Если же кровь нужна только для постановки реакции, вполне достаточно 1-2 мл. тогда берут кровь из пальца проколом иглой Франка.

АГ для реакции агглютинации являются соответствующие живые ил убитые культуры бактерий. Живыми культурами пользуются тогда, когда агглютинация ставится с целью определения вида бактерий, выделенных из какого-либо субстрата.

Диагностикумы – диагностические препараты, содержащие АГ и используемые для обнаружения АТ.

24 Реакция преципитации и ее значение, область применения. Методы постановки. Преципитирующие сыворотки, их получение и титрование. Использование реакции преципитации в диагностике инфекций.

Реакции преципитации основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии АГ с АТ. РП позволяют выявлять незначительные количества АГ. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси с АГ. Метод имеет много разновидностей.

Реакция кольцепиципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую АГ, и чрез несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата.

Реакции микропреципитации применяют для нефелометрического выявления АТ в небольших образцах сыворотки.

Преципитация в геле – на агаре с ее помощью определяют токсигенность выделенных бактерий. При дифтерии, стаф.токсикозе, для определения клеточного иммуноглобулина в сыворотке крови.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить минималейшие следы белка – антигена (до разведения 1:100000 и выше), благодаря чему преципитация практически стала важной реакцией в химии, биологии и т.д.

Чрезвычайно большое значение реакция преципитации имеет в судебномедицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови не только в свежем и жидком состояниях, но также и в высушенном, например, в пятнах очень давнего происхождения на одежде.

В санитарной практике реакция преципитации является методом для определения фальсификации мясных, мучных и других препаратов.

Для серологического диагноза пользуются реакцией преципитации в тех случаях, когда АГ может быть получен только в жидком состоянии, например в вытяжке из инфицированных органов, в спинномозговой жидкости, в моче больного и т.д.

Реакции преципитации можно ставить как с веществами белковой природы – полноценными АГ, так и гаптенами – неполноценными АГ, которые сами по себе не могут вызывать образование АТ, но могут вступать в соединение с ними.

Постановка реакции. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

1. преципитирующую сыворотку, приготовленную путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном;

2. исследуемый АГ в виде отцентрифугированного или профильтрованного прозрачного раствора (экстракт их микробных тел, патологических субстратов от больного, органов, кровяных пятен, сывороточные белки и т.д.) Перед постановкой реакции разводят АГ – физиологическим раствором не менее чем на 1:1000;

3. физиологический раствор (для разведения сыворотки и АГ);

4. специальные узкие (не шире 0,75 см) пробирки с конусообразным дном и очень прозрачного стекла;

5. пастеровские пипетки;

Обязательным условием является полная прозрачность участвующих в реакции агглютинации ингредиентов – сыворотки и АГ. В противном случае результаты реакции будут не ясны.

В пробирку наливают 0,2 мл преципитирующей сыворотки; затем при помощи пастеровской пипетки осторожно наслаивают на сыворотку 0,2 мл АГ (спускают жидкость по стенке пробирки так, чтобы она не смешивалась с сывороткой, а образовала над ней верхний слой). Добавив АГ. Пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции сразу же или в течение 5-10 минут на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо от выпавшего в осадок АГ. Степень реакции оценивается по величине кольца и времени его проявления.

К опыту ставится несколько контролей, а именно: 1) заведомо известны АГ + специфическая преципитирующая сыворотка; 2) преципитирующая сыворотка + физиологический раствор; 3) нормальная сыворотка + исследуемый АГ.

25 Реакция иммунного лизиса как один из механизмом иммунитета. Компоненты реакции, практическое использование.

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки при инфекции является ее способность растворять (лизировать) м/о или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят названия лизинов. В зависимости от АГ они точнее называются бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами и т.д.

Лизины способны проявлять свое лизирующее действие на АГ только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент является составной частью любой свежей сыворотки, как нормальной, так и иммунной. При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается.

Т.о. реакция лизиса происходит при участии двух компонентов: одного специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (АТ), и другого неспецифического, присущего любой сыворотке, как иммунной, так и нормальной (комплемент).

Свежеизвлеченная из организма иммунная сыворотка способна к лизису, так как содержит и АТ и комплемент. Если же пользуются иммунной сывороткой, стоявшей или подвергнутой подогреванию и вследствие этого утратившей комплемент, то лизис произойдет только при условии добавления комплемента, т.е. свежей сыворотки. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее инактивируют нагреванием при 56 градусов в течение 30 минут (для разрушения имеющегося в ней комплемента) и прибавляют к ней строго определенное количество комплемента. В качестве комплемента принято пользоваться свежей сывороткой нормальной морской свинки.

При дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.

26. Реакция связывания комплемента в диагностике инфекционных заболеваний. Практическое применение, компоненты реакции.

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения АГ в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, так и растворимых Г. Последнее связано с тем, что комплемент связывается с Fc- фрагментом АТ независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом АГ-АТ за счет Fc-фрагментов последнего и на вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия.

Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплиментарность.

Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при температуре 37 градусов в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Т.о в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой АГ-АТ, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой АГ-АТ, т.е на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкратной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++

27 Неполные антитела. Реакция Кумбса (прямая и непрямая). Обнаружение антител к резус фактору у беременных женщин.

Неполные АТ – АТ, имеющие только один активный центр – являются одновалентными.

Реакция Кумбса.

Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллезе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) АТ.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

Иммунофлюоресценция

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель, дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –

отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании

препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и

наличие и титр специфических антител. Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой

иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.

29. Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины, вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов, для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,

поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН in vivo может быть использована для определения степени напряженности антитоксического иммунитета в организме человека (проба Шика).

Токсин – яд микробного происхождения. Токсины микробов делятся на эндотоксины и экзотоксины. Характеристика токсинов см. тема №6.

Анатоксин – обезвреженный токсин. Получают из экзотоксинов путем их обработки формалином и теплом. Анатоксин не обладает ядовитостью, при этом сохраняет антигенные и иммуногенные свойства токсина. Сила

действия анатоксина измеряется в ИЕ. ИЕ (иммуногенная единица) – это такое количество анатоксина, которое в смеси с 1 АЕ сыворотки дает инициальную флоккуляцию. Титр анатоксина – количество ИЕ в 1 мл.

Анатоксины титруют в реакции флоккуляции. Анатоксин используется в качестве вакцины для создания активного антитоксического иммунитета. Примером таких вакцин являются дифтерийный анатоксин, столбнячный

анатоксин и др. Анатоксин используется также дл получения антитоксических сывороток.

Антитоксин или антитоксическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к токсину. Антитоксические сыворотки – это гетерологичные сыворотки, их получают путем гипериммунизации лошадей соответствующими анатоксинами с последующим взятием у животных крови и получения сыворотки. Содержание антитоксина в антитоксических сыворотках выражается в международных единицах (ME), принятых ВОЗ. Например, 1 ME противостолбнячной сыворотки соответствует ее

минимальному количеству, нейтрализующему 1000 минимальных смертельных доз (DLm) столбнячного токсина для морской свинки массой 350 г. 1 ME противоботулинического антитоксина - наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее 10000 DLm ботулинического токсина для мышей массой 20 г. 1 ME противодифтерийной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 100 DLm дифтерийного токси-на для морской свинки массой 250 г.

30. Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм РФ сходен с таковым реакции преципитации. В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки

31. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод являетсянеконкурентным . Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным .

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

1. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антигенконкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные типы тест-систем (диагностических наборов) в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

1. Лизатные - в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

2. Рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

3. Пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Теории иммунитета

1) Эрлиха теория иммунитета (теория боковых цепей) - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена.

2) Клонально-селективная теория , теория Бернета - теория, согласно которой в организме возникают клоны клеток, иммунокомпетентных в отношении различных антигенов; антиген избирательно контактирует с соответствующим клоном, стимулируя выработку им антител.

1. Антитела и лимфоциты с необходимой специфичностью уже существуют в организме до первого контакта с антигеном.

2. Лимфоциты, участвующие в иммунном ответе, имеют антигенспецифичные рецепторы на поверхности своих мембран. В случае B-лимфоцитов рецепторами являются молекулы той же специфичности, что и антитела, которые эти лимфоциты впоследствии продуцируют и выделяют.

3. Каждый лимфоцит несет на своей поверхности рецепторы только одной специфичности.

Лимфоцит, сенсибилизированный антигеном, проходит несколько стадий пролиферации и формирует клон плазматических клеток. Плазматические клетки синтезируют антитела только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцит-предшественник. Сигналами к пролиферации служат связывание антигена и цитокины, выделяемые другими клетками (в первую очередь, Т-хелперами. Сами активированные В-лимфоциты также выделяют цитокины.

3) Селективную теорию образования антител сформулировал Ерне, он предположил, что в организме синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде естественных антител. Функция их состоит в том, чтобы избирательно связываться с соответствующим антигеном и таким способом доставлять его неким клеткам организма, для которых они служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, т.е. к образованию антител. Это была первая теория, которая объясняла также феномен иммунологической толерантности, принимая, что любые естественные антитела направленные против собственных антигенов будут немедленно абсорбироваться тканями организма, и таким образом не могут запустить образование аутоантител.

34. Иммунологи́ческая толера́нтность - способность иммунной системы специфически не реагировать на конкретный антиген. Например, при беременности развиваетсятолерантность иммунной системы матери

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
РЕАКЦИИ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ФГБОУ
ВО ТГМУ 2016Г

план

ПЛАН
1. Серологические реакции, которые используются
для серологической диагностики.
2.Серологические реакции, которые используются
для серологической идентификации.
3.Современные методы Иммунологических
исследований при инфекционных болезнях:
(Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный
анализ, генодиагностика,
полимеразная цепная реакция).
4.Серологические реакции, которые используются в
вирусологии.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

ВСЕ СЕРОЛОГИЧНЫЕ
РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ
С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ:
для выявления антител в сыворотке больного
с помощью стандартных антигеновдиагностикумов – для серологической
диагностики инфекционной болезни;
для определения неизвестных антигенов
(бактерий, грибов, вирусов) за известными
стандартными сыворотками-антителами –
для серологической идентификации
возбудителей.

классифиация

КЛАССИФИАЦИЯ
Иммунные реакции подразделяются на простые и
сложные. Для их постановки необходимы
основные два компонента: антиген и антитело.
К простым реакциям, применяемым для
диагностики, относятся реакции агглютинации,
реакции преципитации, реакции нейтрализации.
К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный
метод, радиоиммунный метод,
иммуноферментный метод,
иммунолюминесцентный метод исследования,
метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание)
внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок
корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а
также частиц с адсорбированными на них антигенами под
влиянием антител в среде с электролитом.
Реакция протекает в две фазы.
В первой фазе происходит специфическая адсорбция
антител на поверхности клетки или частицы, несущей
соответствующие антигены,
Во второй - образование агрегата (агглютината) и
выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит
только в присутствии электролита (раствор хлорида
натрия).

Агглютинат

АГГЛЮТИНАТ
Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и
крупнохлопчатый.
Мелкозернистый – это результат
взаимодействия мелких бактерий,
крупнохлопчатый – бактерий,
имеющих жгутики.

Реакция агглютинации-типы

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ-ТИПЫ
Все реакции агглютинации
подразделяются на два типа:
ориентировочные (ОРА), которые
выполняются на стекле,
развернутые (РРА) – выполняются в
пробирках с титрованием сыворотки.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И
ЧУВСТВИТЕЛЬНА.
Повысить специфичность и чувствительность
реакции можно путем разведения исследуемой
сыворотки до ее титра или половины титра.
Титром сыворотки называется то ее максимальное
разведение, в котором обнаруживается
агглютинация антигена.
Чем выше титр антител, тем достовернее
результаты реакции.
Чтобы дифференцировать причину
положительной реакции (ранее перенесенная
инфекция, вакцинация или текущее заболевание),
оценивают динамику нарастания титра
антител, которое наблюдается только при
текущей инфекции..

Основные цели

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ
Ориентировочные реакции также могут
иметь две цели:
Идентификация микробного вида (с
использованием известной иммунной
сыворотки).
Поиск антител в сыворотке крови
пациента с использованием известного
микробного диагностикума.

10. Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ

11. ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРА - ориентировочной реакции агглютинации

12. Схема ориентировочной реакции агглютинации.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ
АГГЛЮТИНАЦИИ.
Этапы выполнения реакции:
На обезжиренное стекло нанести
каплю физиологического раствора.
Внести петлей исследуемую культуру
бактерий, равномерно распределить в
капле физиологического раствора
Добавить каплю специфической
агглютинирующей иммунной
сыворотки
Учесть результат реакции.
Положительной считается реакция,
когда в капле происходит
просветление жидкости и
формирование агглютината.

13. ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

++++
Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление
жидкости. Результат положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над
осадком слегка мутновата. Результат положительный
++
Слабая
агглютинация:
осадок
небольшой,
жидкость
непрозрачная.
маленький,
надосадочная
Результат слабоположительный
+
Следы
агглютинации:
осадок
непрозрачная. Сомнительный результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.
жидкость

14. модификации Реакция агглютинации: это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ
МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА.
Реакция Минкевича позволяет определить наличие
противотуляремийных антител у инфицированного
пациента.
Необходимые ингредиенты:
Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора
из пальца больного
Дистиллированная вода
Туляремийный диагностикум.

15. Этапы выполнения реакции Минкевича:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА:
На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента
Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов
Внести каплю туляремийного диагностикума
Учесть результаты.
Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна
агглютината.

16. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить
антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента,
но и определить титр антител.
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка пациента
Физиологический раствор
Бруцеллезный диагностикум

17. Принцип метода

ПРИНЦИП МЕТОДА
основан на использовании большого стекла фотопластины,
концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в
нарастающих или уменьшающихся объёмах,
дополняемой до определённого уровня физиологическим
раствором, что приравнивается к разным разведениям, и
окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей
видимости образующегося агглютината.
Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём
лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при
+37Сº.
На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от
нескольких больных.
Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината
разной активности в зависимости от разведений.

18. реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их сер

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ
ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА
:
Данная реакция основана на способности
родственных групп бактерий адсорбировать из
антисыворотки только групповые антитела при
сохранении в ней типоспецифических антител.
Полученные сыворотки называются монорецепторным,
так как содержат антитела только к одному
определенному антигену.
При наличии у разных бактерий одинаковых или
сходных групповых антигенов они могут
агглютинироваться одной и той же антисывороткой,
что затрудняет их идентификацию.

19.

Принцип метода:
Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител
методом адсорбции
специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и
специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ -
только групповые.
В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют
родственные гетерологические АГ.
Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала
агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым
паратифа А.
Диагностикум с
антигенами
брюшного тифа
(АВСД)
Исследуемая
сыворотка с
антителами
(abcd)
2 часа +37C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
abcd
ABC
D
AT
АГ
2 часа +37 C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
ABCD
ABEF
ABCD
ABEF

20. Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ)
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И
АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ)
Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы
полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в
присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена
или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно
быстро – на протяжении 2-7 мин.
Нагруженные антителами частицы латекса широко
используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.
Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в
сыворотке больного.
Такую модификацию РАЛ используют для выявления
противогриппозных, противокраснушных,
протикоревых антител и т.д.

21. Проведение реакции латекс-аглютинации

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
ЛАТЕКС-АГЛЮТИНАЦИИ

22. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм
Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится
белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG
человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на
стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в
окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых
находится активный центр антитела.

23. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая
одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого
материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и
др.) и стафилококкового диагностикума.
Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на
тёмном фоне должна четко будет просматриваться
мелкозернистая агглютинация стафилококков.

24. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ)
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Основана на способности антител взаимодействовать с
антигеном, фиксированным на различных
эритроцитах, которые при этом агглютинируют.
Для постановки этой реакции необходимо приготовление
эритроцитарного диагностикума.
Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов:
антигенный и антительный.

25. Этапы выполнения реакции:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ:
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка крови
инфицированного
пациента
В лунки планшета внести физиологический
раствор в одинаковом количестве -0,25 мл
для разведения сыворотки
В первую лунку внести сыворотку крови
пациента, разведенную в 50 раз в объеме
0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой
и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и
перенести в следующую лунку
Перемешать содержимое и повторить эту
процедуру во всех лунках, предназначенных
для проведения реакции.
Приготовить контроль, для чего в одну
лунку внести 0,25 мл физиологического
раствора
Во все лунки, включая контрольную,
внести по 2 капли приготовленного
эритроцитарного диагностикума и
перемешать путем осторожного
покачивания планшета.
Физиологический раствор
Эритроцитарный
диагностикум
Реакция пассивной
гемагглютинации
выполняется в лунках
иммунологического
планшета.

26. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на
дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в
опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика».
Схема постановки и учета РПГА

27. Критерии учета результатов реакции

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
++++
Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат
положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна
лунки. Результат положительный
++
Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна
лунки. Результат сомнительный
+
Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный
результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадок занимает центральное
положение с округлыми краями.

28. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ.

.
РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Развернутые реакции агглютинации предложены для
поиска антител в сыворотках крови инфицированных
пациентов при некоторых бактериальных инфекциях.
При этом применяются диагностикумы,
приготовленные из микроорганизмов.
Для выполнения этих реакций необходимо
предварительное титрование сыворотки.

29. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ.
Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора
1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или
1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора
1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или
1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора.
В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора.
8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль
сыворотки и контроль антигена.
В контроль сыворотки вносим только разведенную
сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только
взвесь диагностикума.

30. Учет реакции

УЧЕТ РЕАКЦИИ
Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси
диагностикума.
В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках
просветляется, на дно оседает осадок агглютината.
Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки
должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно
мутная взвесь диагностикума.
Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно
видно формирование осадка агглютината.

31. СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты
Содержимое пробирок
Физиологический
раствор
0,85
Контроль
Сыворотки
Антигена
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
в 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
--
%
хлорида натрия, мл
Сыворотка
разведении 1:50 мл
Разведения
Диагностикум,
млрд.
(1: 50)
1: 100
1-2 2к
1: 200
1: 400
1: 800
-
2к
2к
2к
-
микробных В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при
тел в 1 мл.
комнатной температуре
2к

32. Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ
АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ:
В реакции агглютинации они корпускулярные, даже
целые клетки, а в реакции преципитации –
молекулярные, в растворимом состоянии.
Антигенами могут быть экстракты
микроорганизмов, тканей, органов, химические
вещества.
Феномен преципитации заключается в том, что
антитела (преципитины), соединяясь с
растворимыми антигенами (преципитиногенами),
предопределяют образование осадка (преципитата)
или помутнения раствора.
За титр реакции принимают наибольшее разведение
антигена, которое дает положительный результат.

33. Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО
ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРАКТИКЕ:
В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения
видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду
принадлежит выявленная кровь.
Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для
диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы,
дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской
язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех,
щетина).
Реакцию Ухтерлони используют для определения
антигенного состава органов и тканей, как нормальных,
так и опухолевых, количества антигенов в сложных
системах.
Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других
заболеваний.

34. . Выявление АГ в реакции кольцепреципитации.

. ВЫЯВЛЕНИЕ АГ В РЕАКЦИИ
КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ.

35. Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС).
Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых
обследованиях на сифилис.
В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов,
антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический).
Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета.
Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов
применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген
(контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная
сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата).
В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении
1:10 и кардиолипиновый антиген.
После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем
планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в
лунке становится прозрачной.
Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат,
оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4
++++ - положительным. Схема реакции микропреципитации
представлена на рис. 10.

36. Экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА
СИФИЛИСА (ЭДС).

37. Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ)
Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии
антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена
образуют линии и полосы преципитации.
Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной
диффузии, можно проводить количественное определение
антигенов.
Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и
встречной иммунодиффузии позволяет оценивать
иммунохимическое сходство или различие антигенных
компонентов.
Методы иммунодиффузии характеризуются высокой
специфичностью и чувствительностью.
Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации
белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови,
цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты
различных органов и т. д.

38. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Метод объединяет реакцию преципитации в геле с
электрофорезом.
Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его
разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую
канавку.
В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в
течение 1-2 часов.
Различные антигены с разной скоростью перемещаются между
катодом и анодом.
Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через
5-7 суток в геле образуются зоны преципитации.
Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями
(например, амидо черным).

39. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

40. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
дуги преципитации.

41. Реакция бактериолиза

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА
применяется редко, она используется для
дифференциальной диагностики холерного вибриона от
других холероподобных бактерий.
В основе реакции лежит способность специфических антител
образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе
с бактериями,
что приводит к активации системы комплемента по
классическому пути и лизису бактерий.

42. В реакции гемолиза

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА
антигеном служат эритроциты, антителом –
антигемолитические антитела.
При образовании комплекса антиген-антитело начинается
активация комплемента, в результате чего мутная взвесь
эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную
жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода
гемоглобина.
При постановке диагностической реакции связывания
комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как
индикаторная: для тестирования присутствия или
отсутствия (связывания) свободного комплемента.

43. Реакция лизиса и связывание комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ
КОМПЛЕМЕНТА.
Необходимые антиген, антитело и комплемент.
Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или
другие клетки.
Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку
или сыворотку больного.
В зависимости от того, против каких клеток направленное
действие лизины, они имеют свои названия:
против бактерий - бактериолизины, спирохет спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других
клеток - цитолизины.
Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим
путем и вызывает растворение клетки.
Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают
несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

44. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
При образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда
присоединяется комплемент.
Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то
комплемент не связывается, остается свободным в системе.
При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины
свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз
эритроцитов.
Этот принцип и положено в основу РСК.
При соответствии антигена антителу с ним связывается
комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты
барана и гемолитическую сыворотку.
При отсутствии гемолиза заключают, что реакция
положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

45. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
Опытная система
АНТИГЕН
(Бактерия, клетка, вирус и
т.д.)
КОМПЛЕМЕНТ
АНТИТЕЛО
(сыворотка) Комплемент
связался с комплексом
антиген-антитело
Индикаторная гемолитиче
ская система
ЭРИТРОЦИТЫ
БАРАНА (АНТИГЕН)
ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ
СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)
Комплемента нет - связался
с опытной системой.
Без комплемента гемолиз
эритроцитов
невозможен.

46. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).

47. Критерии учета результатов реакции

++++
Полная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная
РСК.
+++
Неполная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета;
положительная РСК.
++
Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость
красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная
РСК.
+
Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная
РСК.
-
Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная
РСК.

48. (РСК)

49. Определение антирезус - антител в сыворотке.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ.
Данная реакция проводится у беременных женщин,
имеющих отрицательный резус-фактор.
В случае, если у отца ребенка положительный резус-фактор,
то у плода возможен как положительный, так и
отрицательный резус.
Для предотвращения резус-конфликта необходимо знать,
образуются ли антирезус-антитела в течение беременности
и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их
титра.

50. Для постановки данной реакции необходимы следующие ингредиенты

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ
НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Исследуемая сыворотка
Эритроциты человека, несущие положительный резус-фактор
(стандартные эритроциты)
Комплемент.
Этапы постановки теста:
В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки
В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных
эритроцитов
Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе.
В качестве положительного контроля используем сыворотку,
имеющую антирезус-антитела; в качестве отрицательного
контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

51. Учет результата ведется по гемолизу:

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ:
В пробирке с отрицательным контролем
наблюдаем осадок эритроцитов
- В пробирке с положительным контролем
– полный гемолиз, то есть
равномерно окрашенная в красный цвет
жидкость
- В исследуемых образцах при наличии
антирезус-антител – полный гемолиз, при
их отсутствии – осадок эритроцитов.

52. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Реакция широко применяется в вирусологии для
определения вида (типа) возбудителя и титра
вируснейтрализующих антител.
Эти антитела обычно выявляются при
смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой
смеси восприимчивым лабораторным животным
или заражением культуры клеток.
На основании выживания животного в первом
случае или отсутствия цитопатического действия
вируса во втором судят о нейтрализующей
активности сыворотки.

53. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)
Основана на свойстве
антисыворотки подавлять вирусную
гемагглютинацию, так как нейтрализованный
специфическими антителами вирус утрачивает
способность агглютинировать эритроциты.
РТГА широко применяется для серодиагностики
вирусных инфекций с целью обнаружения
специфических антигемагглютининов
и для идентификации многих вирусов по их
гемагглютининам (антигенам).

54. РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ

Участвуют меченые антигены или антитела.
К ним относятся реакции
иммунофлюоресценции,
радиоиммунный
иммуноферментный методы.
По своей чувствительности они превосходят
все описанные выше
серологические реакции.

55. Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу) метод экспресс-диагностики,

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО
КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ,
Для выявления микробных антигенов в
тканях использовали меченую
диагностическую сыворотку, содержащую
антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактерий,
вирусов).
Метку антител производят
флюорохромами(изотиоцианат
флюоресцеина)

56. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

включает использование коммерческих реагентов – антигенов
или антител, маркированных ферментами (например,
пероксидазой или щелочной фосфатазой).
Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках
фиксирован антиген или антитело.
После образования иммунного комплекса в систему вносят
субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к
окрашиванию среды.
В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет
непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с
антителом в специфической фазе,
а не анализировать вторичные проявления взаимодействия –
агглютинацию, преципитацию или гемолиз.
Метод отличает высокая чувствительность – обычно
достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

57. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

58. Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ
ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ):
В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген
ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена
для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо
отрицательной
Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут
Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз
Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против
иммуноглобулинов человека, меченные ферментом
Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз
Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и
бензидин
Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте
Проводим визуальный учет результатов и определение оптической
плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

59. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

При правильной постановке анализа в лунке, содержащей
положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он
становится желтым.
В отрицательном контроле цвет прозрачный.
Учет результатов опытных образцов зависит от изменения
цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в
положительном контроле, значит, у данного пациента
обнаружены антитела к ВИЧ.

60. упрощения использования ИФА «безреагентные» системы

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ
Для проведения анализа необходимо только нанести на носитель
образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя,
происходящее вследствие образования продукта ферментативной
реакции.
Преимущества:
не используются радиоактивные изотопы,
стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение
длительного времени,
измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне,
результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без
применения аппаратуры (визуально).
ИФА очень легко поддается автоматизации.

61. Радиоиммунологический анализ (РИА)

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ (РИА)
Преимущество РИА: отсутствует необходимость оценивать
протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как
агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов.
2 варианта:
меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное
число участков связывания со специфическими антителами.
Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие,
должна существовать определенная степень родства между
меченым и немеченым антигеном.
После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а
затем со стандартным меченым антигеном
количество включившегося в состав иммунных комплексов
меченого антигена будет обратно пропорционально количеству
немеченого антигена в исследуемой пробе..

62. Источники информации:

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
Основные А.
.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология,
иммунология и вирусология. -С-П.,2000.
Медицинская микробиология./ Под ред. В.И. Покровского.М.,
2001.
Л.Б.Борисов.Медицинская
микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001
Медицинская микробиология,вирусология /Под
ред. А.А.Воробьева.М.2004.

Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция преципитации (РП)

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

Иммунологические реакции можно классифицировать на четыре типа, исходя из видов участвующих в них антител и модулирующих реакцию клеток, характера антигенов и длительности реакции. Иммунная реакция является очень сложной, с внутрисистемными ауторегуляторными связями на разных уровнях, хотя отдельные реакции обычно классифицируются как функционально разобщенные. Так, одно и то же лекарственное средство (например, пенициллин) у разных больных может вызвать иммунологические реакции как первого, так и второго или третьего типа. Некоторые чрезмерной силы ответные реакции были отнесены к реакциям гиперчувствительности потому, что они приводили к разрушению или повреждению тканей хозяина . Несмотря на это, классификация Gell и Coombs продолжает служить основой для понимания патологической физиологии и того спектра иммунологических реакций, которые практический врач видит в клинике . В табл. 2 приведена характеристика четырех типов иммунологических реакций.
Тип I. Примером реакции первого типа являются анафилактические реакции, которые называются также реакциями гиперчувствительности немедленного типа. Реакция вызывается антителом типа IgE, прикрепляющимся к поверхности тучных клеток и базофильных нейтрофи-

Таблица 2. Классификация иммунологических реакций и Coombis (1975)

Цитотоксическая
реакция
Иммунный комплекс
Г иперчувствитель- ность замедленного типа, клеточноопосредованный иммунитет
Реакция антиген - IgE происходит на поверхности тучных клеток и базофилов с высвобождением медиаторов
Реакция IgG, IgM с антигеном происходит на клеточных мембранах, активируется комплемент, высвобождаются анафилатоксины, разрушаются клетки
IgE и IgM реагируют с антигеном независимо от фиксации и откладываются в микрососудах, комплемент активируется, клетки разрушаются
Не участвуют Специализированные Т-лимфоциты реагируют с антигенами, высвобождаются лимфокины
Анафилаксия Волдыри и эритема на коже
Экзогенная астма
Трансфузионные реакции
Г емолитическая анемия
Резус-конфликт
Сывороточная болезнь Г ломерулонефрит
Контактный дерматит Туберкулиновая реакция

лов; Если к такому прикрепленному антителу IgE присоединится антиген, то активация и дегрануляция клетки приведут к высвобождению различных фармакологически активных веществ, вызывающих классическую анафи- лаксию\ (гл. 2). Однако не все аллергические реакции первого типа являются анафилактическими. К первому типу относятся классическая картина аллергии на введение пенициллина, реакции на пчелиный яд, экзогенно-аллергическая астма и аллергический ринит. Вообще к первому типу относятся все аллергические реакции .
Тип II. Реакции второго типа известны как цитоток- сические реакции. В них участвуют антитела типа IgG или IgM, называемые цитотоксическими антителами. Реакции этого типа возникают тогда, когда антитела соединяются с иммуноспецифическими антигенами. В роли антигенов могут выступать сложные компоненты клеточных мембран (антигены групп крови) или молекулярные компоненты, известные как гаптены, адгезирующие- ся к поверхности эритроцитов (например, пенициллин). Взаимодействие антигена с антителом активирует систему комплемента, которая в свою очередь лизирует клетки. Во время активации комплемента высвобождаются фрагменты пептидов - анафилатоксины, которые вызывают системные реакции. К реакциям второго типа относятся, например, посттрансфузионные реакции на основе несовместимости крови по системе АВО, гемолитическая болезнь новорожденных, аутоиммунные и гемолитические анемии, а также синдром Гудпасчера.
Тип III. Реакции третьего типа известны как реакции иммунных комплексов. Антитела и циркулирующие растворимые антигены образуют нерастворимые комплексы, слишком маленькие для того, чтобы удаляться макрофагами ретикулоэндотелиальной системы печени и селезенки. Вместо этого комплексы откладываются в микроцир- куляторном русле. В реакции участвуют антитела класса IgG или IgM. Взаимодействие антигена с антителами активирует комплемент, вследствие чего возникает воспалительный процесс, локализующийся вокруг отложенных комплексов. Освобожденные анафилатоксины вызывают также миграцию других воспалительных клеток и возникновение васкулита. Механизм повреждения ткани состоит в опосредованном комплементом привлечении к месту фиксации иммунных комплексов полиморфноядерных лейкоцитов. Классическим примером аллерги
ческой реакции III типа является так называемая сывороточная болезнь, возникающая после повторного введения чужеродных иммунных сывороток при змёиных укусах и ботулизме или антилимфоцитарного глобулина. Примерами реакций третьего типа являются такжеваску- литы, возникающие после введения пенициллина, и лекарственная системная красная волчанка.
Тип IV. Реакции четвертого типа известны как клеточно-опосредованные иммунные реакции или реакции гиперчувствительности замедленного типа. Эти реакции не зависят от наличия антител. Вместо выработки антител клеточные антигены или внутрисосудистые протеины активируют лимфоидные клетки, известные как тимусзави- симые лимфоциты. Активированные Т-клетки могут непосредственно убить чужеродные клетки или продуцировать особые вещества - лимфокины, которые организуют иммунный ответ. Лимфокины опосредуют возникновение воспаления на месте расположения чужеродного антигена. Они регулируют действия макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов и других клеток, убивающих чужеродные клетки и организмы. Развитие реакций идет медленно; они появляются только через 18-24 ч, достигают максимума к 48 ч и исчезают через 72-96 ч.
Примерами клеточно-опосредованных иммунных ответов могут служить кожная туберкулиновая проба, отторжение трансплантата, аллергия к сумаху укореняющемуся.
Отклонения клеточно-опосредованной иммунной функции вызывают недостаточность системы нормального иммунного надзора, вследствие чего больные подвергаются риску инфекции, вызванной условно-патогенными возбудителями. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является манифестацией отклонений в системе клеточно-опосредованных иммунных реакций. Субпопуляции Т-лимфоцитов, известных как цитотоксические клетки-супрессоры, при инфицировании вирусом иммунодефицита человека (HTVL-III) претерпевают изменения, вследствие чего развивается СПИД. На фоне такого иммунодефицита могут проявляться инфекции, вызванные условно-патогенными возбудителями (например, Pneumocystis carinii) и лимфопролиферативные синдромы (например, саркома Капоши).

Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

ПЛАН:

Виды иммунных реакций.

Условия проведения серологических реакций.

Требования к сыворотке.

Понятие положительный и отрицательный результат.

ОНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

Виды иммунных реакций.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig)

in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

Серологические реакции: 1) определение, 2) фазы, 3) цели постановки, 4) общая классификация.

1) Определение

Серологические методы исследования (от лат. Serum - сыворотка и logos - учение) с помощью реакции антиген-антитело.

2) Фазы

2 фазы взаимодействия:

I. Специфическая (видимая) – наступает быстро, aнтитела соединяются с соответствующими им антигенами. В эту фазу взаимодействуют детерминантные группы антигенов (АГ) и активных центров антител (АТ).

В образовании комплекса АГ+ АТ участвуют силы:

Кулона;

Ван дер Ваальса

Водородные связи.

Никаких видимых изменений в этой фазе нет. При электронной микроскопии комплекс АГ+АТ в виде решетки.

II. Неспецифическая – наступает медленно, образовавшийся комплекс антиген – антитело реагирует с дополнительным неспецифическим фактором среды, в которых происходит реакция, и это видимо глазом – склеивание, растворение, выпадение хлопьев осадка и т. п. В присутствии электролита снижается заряд, уменьшается растворимость, образуются видимые конгломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

3) Цели постановки :

а) для идентификации антигена (антитело известно-диагностическая сыворотка):

• в патологическом материале (экспресс-диагностика);

  в чистой культуре:

  1. серологическая идентификация (определение вида);

     серотипирование (определение серовара) – определение штамма;

б) для выявления антител (Ig) (антиген известен-диагностикум):

• наличия (качественные реакции);

  количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

4) Общая классификация серологических реакций :

а) простые (2-х компонентные: Ag+Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag+Ig+C);

в) с использованием метки.

Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

Реакция агглютинации (РА) - иммунная реакция взаимодействия суспензии АГ (эритроцитов, бактерий) с АТ в физиологическом растворе.

При агглютинации происходит склеивание частиц АТ с образованием хлопьевидного осадка.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, в которой используют антительный или антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности АТ или АГ).

Эритроциты в этой реакции выполняют роль пассивных носителей.

Оценка результатов РПГА проводится следующим образом:

- при положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно U- или V-образной лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»);

- при отрицательной реакции (отсутствии агглютинации) эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют при диагностике вирусных инфекций. Некоторые вирусы содержат на своей поверхности белок гемагглютинин, склеивающий эритроциты. Добавление специфических противовирусных АТ блокирует вирусный гемагглютинин - гемагглютинация отсутствует.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакцию Кумбса, применяют для определения неполных АТ. Добавление антиглобулиновой сыворотки (АТ против Ig человека) усиливает результаты реакции. РНГА применяют при определении резус-фактора.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1) антиген (агглютиноген) АГ;

2) антитело (агглютинин) АТ;

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул-тел (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

РА используют для:

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены).

Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации).

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки ( известные АТ ).

Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Компоненты:

1. стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки (АТ);

2. исследуемая чистая культура от пациента;

3. физ.раствор.

В исследуемой чистой культуре антигены (АГ) в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Пример:

Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят каплями:

1 дизентерии ;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа ;

(1-2 диагностические сыворотки)
3 -я капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа (определялись антигены).

Для определения АТ в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум , содержащий взвесь известных микробов или их антигенов АГ .

Определение групп крови системы АВО (реакция гемагглютинации (РГА)) – агглютинируют эритроциты.

Компоненты реакции:

1. АГ (эритроциты крови) исследуемая кровь

2. АТ (эритротесты- цоликлоны)

Набор цоликлонов:

Реагент Цоликлон анти-А (розовый)

Реагент Цоликлон анти-В (синий)

Реагент Цоликлон анти-АВ (бесцветный)

3. электролит (физиологический раствор)

Техника определения:

1 .

В лунки планшета наносится по одной капле (0,1 мл) цоликлона анти - А, анти - В и анти – АВ (для контроля).

2.

Рядом с каждой каплей реагента наносится маленькую (0,05-0,01 мл) каплю исследуемой крови.

Затем капля цоликлона смешивается с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой.

3.

Реакция агглютинации развивается в течение первых 3-5 секунд при мягком покачивании пластинки.

Результаты реакции учитываются через 2,5 - 3 минуты после смешивания капель. Слева направо в лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.

Положительный результат-появление зернистого осадка (агглютината).

положительная РА (+)

Отрицательный - осадка нет.

отрицательная РА(-)

4.

Анализ результатов.

O (I ) α β – агглютинации нет

A (II ) β – агглютинация с анти-А

B (III ) α – агглютинация с анти-В

AB (IV )О – агглютинация с анти-А, с анти-В

Схематичное изображение агглютинации.

Антигены АГ на эритроцитах (определяемые) + антитело АТ (цоликлон) диагностическая сыворотка

Учет агглютинации в планшетах

Реакция преципитации:

Реакция преципитации - иммунная реакция взаимодействия АГ в растворимом состоянии с АТ в физиологическом растворе.

При преципитации происходит образование макромолекулярного иммунного комплекса, что проявляется переходом прозрачного коллоидного раствора в непрозрачную суспензию, или преципитат.

Количество обоих реагентов должно быть в строго определенных соотношениях, так как избыток одного из них снижает результат.

Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

1. Реакцию кольцепреципитации ставят в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый АГ. АГ и АТ смешиваются за счет теплового движения молекул, и они взаимодействуют. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо непрозрачного преципитата.

2. Реакцию двойной иммунодиффузии по Оухтерлони проводят в агаровом геле, в лунки которого вносят по схеме либо раствор АГ, либо раствор АТ. АГ и АТ диффундируют в гель навстречу друг другу и при положительном результате реакции образуют иммунные комплексы, видимые как линии преципитации.

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты РА:

преципитирующая сыворотка (известное АТ-преципитин);

исследуемая сыворотка (неизвестный АГ-преципитиноген);

физ. Раствор.

Реакцию преципитации ставят в или в специальных узких пробирках (реакция кольцепреципитации), или в чашках Петри в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцеприципитации

Постановка и учет результатов реакции кольцепреципитации для обнаружения возбудителя сибирской язвы (Асколи реакция).

Постановка .

1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ растворе5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта). Фильтруют.

2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку.

3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт).

Учет .

В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична

С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Реакция преципитации в агаре

Постановка и учет результатов реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии)

Постановка

Ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри.

1. Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой .

2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры .

В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная , должна быть заведомо токсигенной .

Посевы помещают в термостат.

Учет

Анализ проводят через 24-48-72 ч.

Положительный результат - (культура токсигенная) - на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата , « стрелы-усики », которые хорошо видны в проходящем свете.

На рисунке представлена реакция преципитации в агаре на определение токсигенности дифтерийных палочек. Средние культуры не образовали «стрел-усиков», это не токсикогенные возбудители.

Штаммы возбудителя дифтерии могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.

При заболевании все возбудители дифтерии тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре

Сложные серологические реакции ( 3–х компонентные:Aг+Ig+C):

Реакция связывания комплемента (РСК).

Реакцию проводят в два этапа.

На первом этапе АТ взаимодействуют с АГ и комплементом, на втором этапе добавляют индикатор - гемолитическую систему (смесь эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки).

При положительном результате на первом этапе АТ образуют с АГ иммунный комплекс, связывающий комплемент реакционной смеси.

В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на втором этапе, не разрушаются.

В противном случае несвязанный комплемент вызывает лизис индикаторных эритроцитов.

Для ее проведения необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система) (рис.1).

Реакция протекает в две фазы (рис. 3).

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает (рис).

Результат опыта оценивают (рис.2), отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь).

Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 4. Постановка и результат РСК.

Вывод: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса.

Диагностическое значение имеет:

четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) ;

двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Реакции с использованием метки :

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлуоресценции основана на световой индикации комплекса антиген-антитело

Иммуноферментный анализ.

Современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;

2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);

3) исследование гормонального статуса пациента;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

На рисунке твердофазный ИФА – известные АГ (слева) адсорбировн а на лунке планшета, (справа) на лунках планшета известные АТ

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя., конъюгированных с ферментом-меткой.

Постановка ИФА (общий механизм):

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Компоненты реакции:

1. АГ(АТ) известное – на лунке планшета.

2. АТ (АГ) исследуемое.

3. АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)

4.хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент

5. стоп раствор

Основные этапы проведения ИФА

1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Образуется комплекс.

2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ первого этапа. Фермент активизируется.

3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный цвет раствора.

4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.

Учет.

Положительный результат- изменение цвета, на рисунке – желтый цвет.

Иммунохроматографический анализ

Метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых».

К преимуществам ИХА следует отнести:

Быстроту и легкость в использовании;

Малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

Дешевизну для производителя и потребителя;

Возможность производства тестов в больших объемах;

Простоту чтения и интерпретации результата;

Высокую чувствительность и вопроизводимость;

Возможность количественного определения;

Возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

Возможность мультианализа.

Компоненты (нанесены на тест-полоску):

1. Конъюгат с меткой коллоидного золота – специфичен к определяемому АГ.

2. АТ тестовой линии – специфичны к комплексу АТ-АГ

3. АТ контрольной линии – специфичны к конъюгату.

Постановка ИХА:

1.Нанесение образца на обозначенный стартовый участок полоски.

2. Получение результата в виде появления окрашенных полос на месте тестовой и контрольной линии.

Учет

Положительный – при окрашивании тестовой линии.

Отрицательный - при отсутствии окрашивания тестовой линии.

Недостоверный – при отсутствии окрашивания контрольной линии.

Общий механизм ИХА:

1. Образец вносится на стартовое поле (подушку образца) и связывается с конъюгатом (специфичное тело с цветной меткой), которые находятся на подушке конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс.

2. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с АТ тестовой линии. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоса.

3. Не связавшиеся на тестируемой полосе АТ (конъюгат) движется дальше и достигает контрольной линии, связывается с АТ контрольной линии. В результате появляется вторая окрашенная полоса. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.

2. Условия проведения серологических реакций.

1. Наличие гомологичных – соответствующих друг другу антигена и антитела.

2. Чистая, сухая посуда.

3. Определенное соотношение препаратов (чаще всего равное).

4. Обязательное присутствие электролита (изотонический раствор NaCl).

5. рН нейтральный или близкий к слабощелочному.

6. Температура +37°С или комнатная (обязательно плюсовая).

7. Проводится контроль антигена и контроль сыворотки (антител).

3 Требования к сыворотке

Сыворотка должна быть совершенно прозрачная без примеси клеток

Получают на 2 неделе болезни обычно, когда уже есть в наличии антитела.

Кровь берут в количестве 3-5 мл натощак или через 6 ч. после еды.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре или центрифугируют. Отсасывают сыворотку очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определённой схеме соответствующим антигеном (вакциной). Готовят сыворотки обычно на производстве.

4. Понятие положительный и отрицательный результат.

РА.

При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями (см. рисунки выше).

РП.

При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета (см. рисунки выше).

ИФА.

Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

РСК.

Задержка гемолиза - реакция положительна; если комплемент свободен, наблюдается гемолиз - реакция отрицательна (см. рисунки выше).

Результаты реакции Вассермана:

а - полная задержка гемолиза (+ + ++);

б - выраженная задержка гемолиза (+ ++);

в - частичная задержка гемолиза (++);

г - слабая задержка гемолиза (+);

д - полный гемолиз (-).

Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Домашнее задание:

1. Изучите материал

Составьте 3 конспекта по видео