Иммунологические реакции их компоненты цели постановки. Иммунологические реакции: агглютинации, преципитации, лизиса

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig) in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

2.7 Серологические реакции: цели постановки, общая классификация.

Цели постановки :

а) для идентификации антигена:

в патологическом материале (экспресс-диагностика);

в чистой культуре:

серологическая идентификация (определение вида);

серотипирование (определение серовара);

б) для выявления антител (Ig):

наличия (качественные реакции);

количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

Общая классификация серологических реакций:

а) простые (2-х компонентные: Ag + Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag + Ig + C);

в) с использованием метки.

2.8 Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

а) с корпускулярным антигеном:

пластинчатая;

объемная;

непрамая:

латекс-агглютинация;

ко-агглютинация;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) = пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция преципитации:

а) с растворимым антигеном:

объемная (например, реакция кольцепреципитации);

в геле (иммунодиффузия):

простая (по Манчини);

двойная или встречная (по Оухтерлони);

реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) (например реакция флокулляции);

другие варианты:

1. иммуноэлектрофорез;

   иммуноблотинг.

Сложные серологические реакции (3–х компонентные: Aг+Ig+C):

а) видимые:

иммобилизация;

иммунного прилипания;

лизиса (в том числе гемолиза);

б) невидимые:

реакция связывания комплемента (РСК).

2.10 Реакции с использованием метки:

РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

ИФА – иммуноферментный анализ;

РИА – радиоиммунный анализ;

ИЭМ – иммунная электронная микроскопия.

Иммунный ответ. КИО. ГИО

4 Клеточный иммунный ответ

Иммунный ответ (ИО)– это комплекснаястадийная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию .

По механизмам эффекторного действия различают ИО:

– гуморальный (обеспечивается В- системой иммунитета),

– клеточный (обеспечивается Т-системой иммунитета).

В отличие от В-системы иммунитета , которая нейтрализует антиген с помощью антител,

–Т-система иммунитета уничтожает антигены, представленные на клетках, через прямое взаимодействие субпопуляции T-клеток – специфических цитотоксических T-клеток (=CD8 T-клеток = T-киллеров) с измененными собственными или чужеродными клетками;

–Т-клетки распознают не собственно антигенный пептид (эпитоп) , а его комплекс с молекулами МНС I или МНС II .

Реакции КИО лежат в основе:

реакции отторжения трансплантанта,

аллергической реакции замедленного типа,

противоопухолевого иммунитета,

Этапы КИО:

поглощение и процессинг АГ

В качестве антигенпрезентирующих (АПК) клеток в КИО участвуют дендритные клетки или макрофаги.

Процессинг сводится к:

– расщеплению исходной молекулы до уровня специфических пептидов,

– активации синтеза в АПК антигенов МНС I или II классов,

– образованию комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса и к экспрессии его на мембране АПК.

презентация АГ:

– комплекс антигенный пептид + МНС I презентируется для опознания прецитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом CD8+;

комплекс антигенный пептид + МНС II - Т-хелперам, имеющим фенотип CD4+.

– узнавание Т-клеточным рецептором (TCR) комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса. При этом важную роль играют адгезивные молекулы CD28 на Т-лимфоцитах и CD80 (CD86) – на АПК, выполняющие функцию корецепторов;

активация Т-лимфоцитов – переход из стадии покоя в стадию G 1 клеточного цикла. Условие активации – передача сигнала от клеточной мембраны к ядру. В результате образуется ряд транскрипционных молекул, активирующих гены важнейших цитокинов. Синтезируются ИЛ2 и рецептора для него – ИЛ2R, гамма-интерферон (γИФН) и ИЛ4.

Пролиферация – размножение специфического по отношению к данному антигену клона Т-лимфоцитов (клональная экспансия ) под действие ИЛ2. Лишь размножившийся клон лимфоцитов способен выполнять функции по элиминации антигена.

Дифференцировка – процесс специализации функций клеток внутри специфического клона:

– под действием γИФН активируется процесс синтеза антигенпрезентирующими клетками ИЛ12, который воздействует на исходные специфические Т-хелперы нулевые (Th0) и тем самым способствует их дифференцировке в Тh1.

– Th1 продуцируют γИФН, ИЛ2 и факторы некроза опухоли альфа- и бета- , а также контролируют развитие клеточного иммунного ответа, и гиперчувствительности замедленного типа.

эффекторная фаза – уничтожение клетки-мишени. Происходит активация киллерной функции прецитотоксических лимфоцитов (специфических киллеров), натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов. ПреЦТЛ дифференцируются в ЦТЛ, экспрессируя рецепторы к ИЛ2.

ЦТЛ убивают внутриклеточные бактерии и простейшие, инфицированные вирусами клетки, а также клетки опухоли и аллогенного трансплантата.

Каждый ЦТЛ способен лизировать несколько чужеродных клеток-мишеней.

Этот процесс осуществляется в три стадии:

распознавание и контакт с клетками-мишенями;

летальный удар – перфорины и цитолизины действуют на мембрану клетки-мишени и образуют в ней поры;

лизис клетки-мишени – через образовавшиеся под влиянием перфоринов и цитолизинов поры проникает вода, разрывающая клетки.

Схема клеточного иммунного ответа

Закономерности развития гуморального иммунного ответа на проникновение тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов.

Протекание процесса презентации АГ лимфоциту зависит от типа антигена. Все АГ делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые. Большинство антигенов тимусзависимые. Презентация тимуснезависимого антигена проходит по схеме: М––>Вл. Презентация тимусзависимого антигена проходит по схеме: М––>Тх2––> Вл.

Тимуснезависимый антигенов мало. Они являются сильными митогенами. Должны быть полимеризованного характера и иметь большое количество одинаковых эпитопов (например: липополисахариды клеточной Гр(-) микроорганизмов). На поверхности В-лимфоцитов очень большое число антигенраспознающих рецепторов одной специфичности. Эти рецепторы подвижные. Как только на них действует липополисахарид, происходит агрегация рецепторов, приводящая к концентрированию их в одном месте в виде «шапочки» – это первый сигнал к активации В-лимфоцитов. Второй сигнал В-лимфоциты получают от макрофага в виде медиатора, которым является ИЛ1. После этого происходит активация В-лимфоцита и трансформация его в бластные клетки; они увеличиваются в размере, 6-7 раз делятся и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулин малой специфичности IgМ.

Тимуснезависимый антиген индуцирует пролиферацию клона клеток с АГ-специфическими рецепторами. Особенностью ИО в данном случае заключается в следующем: 1) не происходит переключения синтеза IgМ на синтез иммуноглобулинов класса G и др. классов; 2) тормозится ИО, т.к. не образуются клетки памяти; 3) быстро возникает иммунологическая толерантность.

Тимусзависимые антигены вызывают ИО, включающий следующие стадии: 1) Презентация антигена Т-хелперу; 2) специфическое распознание Т-хелпером антигена на поверхности макрофага через антигенраспознающий рецептор. Распознание идет в комплексе с молекулами HLA–DR. На этом этапе, получив антигенную информацию от макрофага, Т-хелпер получает медиаторный сигнал от макрофага в виде ИЛ-1. Это активирует Т-хелпер. Активированный Т-хелпер выделяет различные лимфокины (ИЛ-2,ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, митогенный и бластогенный фактор), что способствует экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов для ИЛ-2 и ИЛ-4. Это продукты самого Т-хелпера, которые поддерживают его в активном состоянии. Кроме этого, эти продукты активируют В-лимфоциты вместе с ИЛ-1, который В-лимфоцит получает от макрофага.

Вопрос № 26

(иммунологические реакции: агглютинации, преципитации, лизиса)

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината

Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.

^ Ориентировочная реакция агглютинации (РА) Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки. Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.

Реакции прямой гемагглютинации. Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов .

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.
В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.
Реакция лизиса

В основе лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплимента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации холерных и холероподобных вирионов)
^ Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с АТ-ми в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется как индикаторное при постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК), для титрования комплемента и гемолитической сыворотки.
^ Реакция локального гемолиза в геле -является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах.

Вопрос№27

(Иммунные сыворотки. Титр агглютинирующий, испытуемой сыворотки, диагностический титр. Диагностикумы, их виды)
Сы воротки имму нные, препараты из крови животных и человека, содержащие антитела против возбудителей инфекционных заболеваний или продуктов их жизнедеятельности. Применяются длясеродиагностики , серопрофилактики и серотерапии . В процессе приготовления С. и. сыворотка крови иммунизированных определёнными антигенами животных или людей (доноров) либо переболевших подвергается различной, в зависимости от типа и назначения С. и., обработке: очистке, при которой удаляются балластные вещества и выделяются активные, прежде всего глобулиновые, фракции белков; концентрации.

Введение человеку С. и. из крови животных может сопровождаться осложнениями (сывороточная болезнь , анафилактический шок). Концентрированные С. и. - гамма-глобулины (правильнее - иммуноглобулины, так как в них сохраняются различные глобулиновые фракции) из крови человека - практически не вызывают этих осложнений и медленнее выводятся из организма. В зависимости от назначения различают лечебно-профилактические и диагностические С. и. Лечебно-профилактические С. и. подразделяют на антитоксические - против ядовитых продуктов жизнедеятельности микробов (например, противостолбнячная, противодифтерийная, противогангренозная) и против последствий укуса ядовитых змей и насекомых; антибактериальные - воздействующие на микроорганизм (противосибиреязвенный гамма-глобулин) и антивирусные (например, противокоревой, антирабический, противогриппозный гамма-глобулины). Диагностические С. и. готовят, применяя различные антигены в зависимости от характера реакции, для которой они используются. Их применяют для идентификации возбудителей инфекционных болезней, а также в экспериментальных исследованиях и др.

. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления

(через 10-21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.
Титр диагностический

титр Ат к конкретному возбудителю болезни в с-ке крови, выявляемый у большинства лиц на определенной фазе болезни и не наблюдающийся у большинства здоровых людей. Подтверждает клинический диагноз болезни.
Диагностикумы - это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций .

Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.).
Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.
Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью .

Вопрос№28

(Люминесцентная,темнопольная,фазовоконтрастная,электронная микроскопия)
Люминесцентная микроскопия - оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нем
Темнопо́льная микроскопи́я - вид оптической микроскопии , в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца. Темнопольная микроскопия хорошо подходит для получения изображений живых и неокрашенных биологических образцов, таких, как отдельные водные одноклеточные организмы.

Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов - простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток
Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные - фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы
^ Электронная микроскопия - это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1-5 Å).
Действие электронного микроскопа основано на использовании направленного потока электронов , который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).
Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз.
Вопрос№30

(Микроскопический метод диагностики инфекционных болезней)
Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить возбудителя непосредственно в материале от больного, пользуясь световым микроскопом. На основании анализа морфологических особенностей микроба можно достаточно точно определить его вид. Материалом для исследования могут быть кровь, костный мозг, мазки или смывы со слизистых оболочек полости рта и носа, моча, выделения из уретры, стул, спинномозговая жидкость, слюна, мокрота, гной из карбункулов или фурункулов и т.п

Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить малярию, лейшманиоз, лямблиоз, гельминтозы и другие инфекционные заболевания

Вопрос№31

(Культуральный (бактериологический,вирусологический,микологический метод диагностики инфекционных заболеваний)
^ Микробиологическое (бактериологическое или вирусологическое) исследование Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя . В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

На втором этапе бактериологического метода исслебования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Бактериологическое исследование проводят также для контроля эффективности лечения больного, выявления реконвалесцентного бактерионосительства, источника возбудителя болезни в эпидемическом очаге, обследование лиц, принадлежащих к декретированным группам (работники пищевой промышленности, общественного питания, детских дошкольных учреждений и т.д.).

Выращивать и идентифицировать вирусы значительно тяжелее, чем бактерии. Прежде всего, это связано с тем, что вирусы размножаются только внутри живых клеток. Поэтому такие исследования проводят в специальных вирусологических лабораториях, используя вместо питательных сред культуры разных клеток: куриные эмбрионы, клетки тканей человека или животных.

Микологические исследования осуществляются реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования проводят при диагностике кандидозов путем определения нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода Candida, а также глубоких микозов.

Вопрос№32

(Серологический метод диагностики инф. Болезней)

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитела, антиген) неизвестным является сыворотка крови. Постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами (диагностикумами). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании “парных” сывороток крови больного, взятой в первые дни болезни и через разные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Для этой цели используются диагностические иммунные сыворотки, полученные от животных после вакцинации соответствующими антигенами. Это серологическая идентификация микроорганизмов.

При инфекционных заболеваниях серологические исследования для обнаружения специфических антител являются более доступным методом лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования являются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний.
Методы серологических реакций

Вопрос№33

(Аллергический метод диагностики инфекционных заболеваний)
Аллергический метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью аллергических проб - накожных и внутрикожных. Метод выявляет повышенную чувствительность замедленного типа, возникающую в организме при многих инфекционных заболеваниях. Введение аллергена накожно или внутрикожно используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза и других заболеваний.
Аллергологический метод диагностики инфекционных заболеваний основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии, гиперсенсибилизации) при введении в детский организм специфических аллергенов. Аллергены применяют в небольшом количестве. В основном их вводят внутрикожно или наносят на кожу, реже - на слизистую оболочку глаза. Для постановки внутрикожной пробы используют туберкулиновый или инсулиновый шприц. Тонкой иглой срезом вверх вводят 0,1 мл аллергена в кожу внутренней поверхности предплечья. Вводить препарат начинают после того, как срез иглы полностью войдет в кожу. Если манипуляция выполнена правильно, на месте введения аллергена образуется небольшой беловатый, плотный пузырек, напоминающий лимонную корку. Он исчезает через 10-15 минут. При заболевании (наличия специфической аллергии) через 24-72 часа в месте введения аллергена возникает реакция в виде инфильтрации с покраснением.

Аллергические реакции становятся положительными с 8-10-го дня заболевания. Чаще всего их применяет для диагностики туберкулеза (реакция Манту), бруцельоза (реакция Бюрне), туляремии, токсоплазмоза, орнитоза.

Вопрос №34

(Биологический метод)

биологический метод - осуществляют путем выделения возбудителя при заражении лабораторных животных, которые восприимчивы к данному заболеванию. Этот метод дорогостоящий, поэтому применяется ограниченно;

Вопрос№34

(Молекулярно-генетический метод)
Всё более востребованными становятся молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), «BROAD-R

В настоящее время из молекулярно-генетических методов исследования наиболее широкое применение в диагностике инфекционных болезней нашла ПЦР, которая благодаря появлению доступных и удобных в использовании приборов завоевала прочное место в повседневной работе лабораторий. В основе ПЦР лежит искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

Вопрос№36

(Характеристика возбудителя ВИЧ-инфекции. Принципы микробиологической диагностики. Препараты для специфического лечения)

Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита.

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.

Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.

Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.

Клиника: поражается дыхательная система (пневмония, бронхиты); ЦНС (абсцессы, менингиты); ЖКТ (диареи), возникают злокачественные новообразования (опухоли внутренних органов).

ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий: 1) инкубационный период, составляющий в среднем 2-4 недели; 2) стадия первичных проявлений, характеризующаяся вначале острой лихорадкой, диареей; завершается стадия бессимптомной фазой и персистенцией вируса, восстановлением самочувствия, однако в крови определяются ВИЧ-антитела, 3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадией- СПИДом.

Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.

Лечение:

применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина - азидотимидин и фосфазид.

Терапия ВИЧ-инфицированных лиц подразумевает постоянный контроль иммунного статуса организма, профилактику и лечение возникающих вторичных инфекций, контроль над развитием новообразований. Зачастую ВИЧ-инфицируемым лицам требуется психологическая помощь и социальная адаптация.

Вопрос№37

(Характеристика возбудителей вирусных гепатитов В,С,дельта. Принципы микробиологической диагностики, препараты для лечения гепатита В)
Вирус гепатита В - семейство Hepadnaviridae Морфология: ДНК-содержаший вирус сферической формы. Состоит из сердцевины, состоящей из 180 белковых частиц, составляющих сердцевинный НВс-антиген и липидсодержащей оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНК, фермент ДНК-полимераза, обладающая ревертазной активностью, и концевой белок НВе-антиген.Резистентность . Высокая к факторам окружающей среды и дезинфицирующим веществам. Вирус устойчив к длительному воздействию кислой среды, УФ-излучению, действию спирта, фенола.

Развитие инфекционного процесса при попадании в кровь. Заражение происходит при парентеральных манипуляциях (инъекциях, хирургических вмешательствах), переливании крови.Патогенез и клиника заболевания. Инкубационный период 3-6 месяцев. Инфекционный процесс наступает после проникновения вируса в кровь. ВГВ из крови эндоцитозом проникает в гепатоцит. После проникновения вируса происходит достраивание плюс-нити ДНК ДНК-полимеразой до полноценной структуры. Клиническая картина характеризуется симптомами поражения печени, в большинстве случаев сопровождается развитием желтухи.Иммунитет. Гуморальный иммунитет, представленный антителами к HBs-антигену, защищает гепатоциты от вируса, элиминируя его из крови.Клеточный иммунитет освобождает организм от инфицированных гепатоцитов благодаря цитолитической функции Т-киллеров. Переход острой формы в хроническую обеспечивается нарушением Т-клеточного иммунитета.

Микробиологическая диагностика. Используют серологический метод и ПЦР. Методами ИФА и РНГА в крови определяют маркеры гепатита В: антигены и антитела. ПЦР определяют наличие вирусной ДНК в крови и биоптатах печени. Для острого гепатита характерно обнаружение HBs антигена, НВе антигена и анти-HBc-IgMантитела.

Лечение. Использование интерферона, интерфероногенов: виферона, амиксина, ингибитора ДНК-полимеразы, препарата аденинрибоно-зида.

Профилактика. Существует вакцины первого поколения полученные из плазмы крови хронических носителей.Исключение попадания вируса при парентеральных манипуляциях и переливаниях крови (применением одноразовых шприцев, проверкой на гепатит В по наличию HBs-антигена в крови доноров крови).

Вирус гепатита D - дефектный вирус, не имеющий собственной оболочки. Вирион имеет сферическую форму, который состоит из однонитчатой РНК и сердцевинного HDc-антигена. Для репродукции данного вируса необходимо участие вируса-помощника,роль которого играет вирус гепатита В. Различают три генотипа вируса. Все генотипы относятся к одному серотипу.

Резервуаром BFD в природе являются носители ВГВ. Заражение BFD аналогично инфицированию ВГВ.

осуществляется серологическим методом путем определения антител к BFD методом ИФА. Профилактика: все те мероприятия, которые используют для профилактики гепатита В. Для лечения используют препараты интерферона. Вакцина против гепатита В защищает и от гепатита D.
Морфология. Сложноорганизованный РНК-содержащим вирус сферической формы. Геном представлен одной линейной «+» цепью РНК, обладает большой вариабельностью.

Антигенная структура. Вирус обладает сложной антигенной структурой. Антигенами являются: 1. Гликопротеины оболочки 2. Сердцевинный антиген НСс-антиген 3. Неструктурные белки.

Резистентность. Чувствителен УФ-лучам, нагреванию до 50С.

Эпидемиология. Наиболее часто ВГС передается при переливаниях крови, трансплацентарно, половым путем.

Клиника: Часто встречаются безжелтушные формы, течение инфекции в острой форме, в 50 % случаев процесс переходит в хроническое течение с развитием цирроза и первичного рака печени.

Микробиологическая диагностика: Используются ПЦР и серологическое исследование.

Вопрос№38

(Характеристика возбудителей полиомиелита. Принциы микробиологической диагностики. Препараты для спец. Профилактики и лечения)

Структура. По структуре полиовирусы - типичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.
Морфология : мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

^ Антигенные свойства: Различают 3 серотипа внутри вида: 1, 2, 3, не вызывающие перекрестного иммунитета. Все серотипы патогенныдлчеловека.
Патогенез и клиника. Естественная восприимчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь, а затем в ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле.

Иммунитет. После перенесенной болезни остается пожизненный иммунитет. Иммунитет определяется наличием вируснейтрализующих антител, среди которых важная роль принадлежит местным секреторным антителам слизистой оболочки глотки и кишечника (местный иммунитет). Пассивный естественный иммунитет сохраняется в течение 3-5 недель послерожденияребенка.

^ Микробиологическая диагностика . Материал для исследования - кал, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы.
Вирусы полиомиелита выделяют путем заражения исследуемым материалом первичных и перевиваемых культур клеток. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток. Важное значение имеет внутривидовая дифференциация вирусов, которая позволяет отличить патогенные штаммы от вакцинных штаммов, выделяющихся от людей, иммунизированных живой полиомиелитной вакциной. Различия между штаммами выявляют с помощью ИФА, реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также вПЦР.
Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузиипоМанчини.
Лечение . Патогенетическое. Применение гомологичного иммуноглобулина для предупреждения развития паралитических форм ограничено.
Все больные с подозрением на полиомиелит подлежат срочной госпитализации. Лечение проводят в условиях боксированного отделения инфекционного стационара в течении 3-4 недель. Основными критериями перехода болезни в восстановительный период являются исчезновение симптомов интоксикации, болевых признаков, нормализация ликвора (спинно-мозговой жидкости)

Профилактика . Основной мерой профилактики полиомиелита является иммунизация. Первая инактивированная вакцина для профилактики – создавала общий гуморальный иммунитет, не формировала местной резистентности слизистых оболочек ЖКТ, не обеспечивала надежную защиту.

Пероральная живая культуральная вакцина из трех серотипов штаммов. Используют для массовой иммунизации детей, она создает стойкий общий и местный иммунитет.

13.1. Реакции антиген-антитело и их применение

При введении антигена в организме образуются антитела. Антитела комплементарны антигену, вызвавшему их синтез, и способны с ним связываться. Связывание антигенов с антителами состоит из двух фаз. Первая фаза - специфическая, при которой происходит быстрое связывание антигенной детерминанты с активным центром Fab-фрагмента антител. Следует отметить, что связывание обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными и гидрофобными взаимодействиями. Прочность связи определяется степенью пространственного соответствия активного центра антитела и эпитопа антигена. После специфической фазы наступает более медленная - неспецифическая, которая проявляется видимым физическим явлением (например, образованием хлопьев при агглютинации и др.).

Иммунные реакции - это взаимодействие между антителами и антигенами, причем эти реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью. Они широко используются в медицинской практике. С помощью иммунных реакций можно решить следующие задачи:

Определение неизвестных антител по известным антигенам (антигенный диагностикум). Такая задача стоит, когда необходимо определить в сыворотке крови больного антител к возбудителю (серодиагностика). Нахождение антител позволяет подтвердить диагноз;

Определение неизвестных антигенов по известным антителам (диагностическая сыворотка). Это исследование проводят при идентификации культуры возбудителя, выделенной из материала больного (серотипирование), а также при обнаружении

антигенов микробов и их токсинов в крови и других биологических жидкостях. Существует много разновидностей иммунных реакций, различающихся по технике постановки и регистрируемому эффекту. Это реакции агглютинации (РА), преципитации (РП), реакции с участием комплемента (РСК), реакции с использованием меченых компонентов (РИФ, ИФА, РИА).

13.2. Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) - это иммунная реакция взаимодействия антигена с антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с адсорбированными антигенами). При агглютинации происходит склеивание корпускулярных антигенов антителами, что проявляется образованием хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что антитела имеют два активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации возбудителя, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в сыворотке крови больного антител к возбудителю (например, реакции Райта и Хеддлсона при бруцеллезе, реакция Видаля при брюшном тифе и паратифах).

Самый простой способ постановки РА - реакция на стекле, это ориентировочная РА, которая применяется для определения возбудителя, выделенного от больного. При постановке реакции на предметное стекло наносят диагностическую агглютинирующую сыворотку (в разведении 1:10 или 1:20), затем вносят культуру от больного. Реакция положительная, если в капле появляется хлопьевидный осадок. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. Если диагностическая агглютинирующая сыворотка неадсорбированная 1 , то ее разводят (до титра - разведения, до которого должна происходить агглютинация), т.е. ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающимися

1 Неадсорбированная агглютинирующая сыворотка может агглютинировать родственные бактерии, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя, выделенного от больного. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости в пробирках. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Реакция сопровождается контролями: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Для определения в сыворотке крови больного антител к возбудителю используют развернутую РА. При ее постановке в пробирках разводят сыворотку крови больного и добавляют в пробирки равное количество взвеси диагностикума (взвесь убитых микробов). После инкубации определяют наибольшее разведение сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок (титр сыворотки). При этом реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) является разновидностью РА. Этот метод обладает высокой чувствительностью. С помощью РНГА можно решить две задачи: определить антитела в сыворотке крови больного, к которой добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум, представляющий собой эритроциты, на которых адсорбированы известные антигены; определить наличие антигенов в исследуемом материале. В этом случае реакцию иногда называют реакцией обратной непрямой гемагглютинацией (РОНГА). При постановке к исследуемому материалу добавляют антительный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности антителами). Эритроциты в этой реакции выполняют роль носителей и пассивно вовлекаются в образование иммунных агрегатов. При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакция коагглютинации используется для определения клеток возбудителя (антигенов) с помощью антител, адсорбированных на Staphylococcus aureus, содержащем белок А. Белок А обладает сродством к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. Благодаря этому антитела связываются с стафилококком опосредованно через Fc- фрагмент, а Fab-фрагменты ориентированы наружу и способны взаимодействовать с соответствующими микробами, выделенными от больных. При этом образуются хлопья.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется при диагностике вирусных инфекций, причем только инфекций, вызываемых гемагглютинирующими вирусами. Эти вирусы содержат на своей поверхности белок - гемагглютинин, который ответствен за реакцией гемагглютинации (РГА) при добавлении к вирусам эритроцитов. РТГА заключается в блокировании антителами вирусных антигенов, в результате чего вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты.

Реакция Кумбса - РА для определения неполных антител. При некоторых инфекционных заболеваниях, например при бруцеллезе, в сыворотке крови больного циркулируют неполные антитела к возбудителю. Неполные антитела называют блокирующими, так как они имеют один антигенсвязывающий участок, а не два, как полноценные антитела. Поэтому при добавлении антигенного диагностикума неполные антитела связываются с антигенами, но не склеивают их. Для проявления реакции добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела к иммуноглобулинам человека), которая приведет к агглютинации иммунных комплексов (антигенный диагностикум + неполные антитела), образовавшихся в первой стадии реакции.

Непрямую реакцию Кумбса применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают неполные одновалентные антирезусные антитела. Они специфически взаимодействуют с резусположительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Поэтому в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку, что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных, обусловленную резус-конфликтом.

РА для определения групп крови основана на агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки к антигенам групп крови А(II), B(III). Контролем являются сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка AB(IV) группы крови, и антигены эритроцитов групп А(П) и B(III). В качестве отрицательного контроля применяют эритроциты группы 0(I), поскольку они не имеют антигенов.

Для определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток.

13.3. Реакция преципитации

РП - это иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами в присутствии электролитов, причем антиген находится в растворимом состоянии. При преципитации происходит осаждение растворимых антигенов антителами, что проявляется помутнением в виде полос преципитации. Образование видимого преципитата наблюдается при смешивании обоих реагентов в эквивалентных соотношениях. Избыток одного из них снижает количество осаждающихся иммунных комплексов. Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

Реакция кольцепреципитации ставится в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый антиген. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета. Реакция кольцепреципитации, с помощью которой определяют наличие антигенов в органах и тканях, экстракты которых кипятят и фильтруют, называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи для определения термостабильного сибиреязвенного антигена).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Эта реакция проводится в агаровом геле. В слое геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки и заполняют их антигеном и иммунной сывороткой соответственно. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в геле и становятся видимыми как линии преци-

питации. Эту реакцию можно использовать для определения неизвестных антигенов или антител, а также для проверки сходства между различными антигенами: если антигены идентичны, линии преципитации сливаются, если антигены неидентичны, линии преципитации пересекаются, если антигены частично идентичны, формируется шпора.

Реакция радиальной иммунодиффузии. В расплавленный агаровый гель добавляют антитела и наносят гель равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Во время инкубации антигены радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Этот метод используется для определения антигенов или антител в исследуемом растворе (например для определения концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови).

Иммуноэлектрофорез. Предварительно электрофоретически разделяют смесь антигенов, затем в канавку, идущую вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую антисыворотку. Антигены и антитела диффундируют в гель навстречу друг другу; взаимодействуя, они образуют дугообразные линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) - разновидность реакции преципитации, которая используется для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Реакцию проводят в пробирках. В пробирке, где анатоксин и антитоксин находятся в эквивалентном соотношении, наблюдается помутнение.

13.4. Реакция связывания комплемента

Антитела, взаимодействуя с соответствующим антигеном, связывают добавленный комплемент (1-я система). Индикатором связывания комплемента служат эритроциты, сенсибилизированные гемолитической сывороткой, т.е. антителами к эритроцитам (2-я система). Если комплемент не фиксируется в 1-й системе, т.е. не происходит реакция антиген-антитело, то сенсибилизированные эритроциты полностью лизируются (отрицательная реакция). При связывании комплемента иммунными комплексами 1-й системы после добавления сенсибилизированных эритроцитов гемолиз от-

сутствует (положительная реакция). Реакция связывания комплемента используется для диагностики инфекционных болезней (гонореи, сифилиса, гриппа и др.).

13.5. Реакция нейтрализации

Микробы и их токсины оказывают повреждающее действие на органы и ткани организма человека. Антитела способны связываться с этими повреждающими агентами и блокировать их, т.е. нейтрализовать. На этой особенности антител основана диагностическая реакция нейтрализации. Ее проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). Например для обнаружения токсинов в материале больного животным 1-й группы вводят материал больного. Животным 2-й группы вводят аналогичный материал, предварительно обработанный соответствующей антисывороткой. Животные 1-й группы при наличии токсина в материале погибают. Вторая группа животных выживает, повреждающее действие токсина не проявляется, так как происходит его нейтрализация.

13.6. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

13.6.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса)

Этот метод используется для экспресс-диагностики. С его помощью можно выявлять как микробные антигены, так и антитела.

Прямой метод РИФ - иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами, причем антитела метят флюорохромом - веществом, способным при попадании света определенной длины волны испускать кванты света также определенной длины волны. Особенность постановки этого метода заключается в необходимости удаления непрореагировавших компонентов, чтобы исключить выявление неспецифического свечения. Для этого проводят отмывание от непрореагировавших антител. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся на темном фоне по периферии клетки.

Непрямой метод РИФ используется чаще предыдущего. Эта реакция проводится в два этапа. На первом этапе антигены взаи-

модействуют с соответствующими антителами, образуя иммунные комплексы. Все компоненты, которые не прореагировали (т.е. не в составе иммунных комплексов), должны быть удалены отмыванием. На втором этапе образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью флюорохромированной антиглобулиновой сыворотки. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные флюорохромом. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа.

13.6.2. Иммуноферментный метод или анализ

ИФА - наиболее распространенный современный метод, используемый для диагностики вирусных, бактериальных, протозойных инфекций, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов и др.

Модификаций ИФА очень много. Широко используется твердофазный неконкурентный вариант ИФА. Его проводят в 96-луночных полистироловых планшетах (твердая фаза). При проведении реакции необходимо на каждом этапе отмывать непрореагировавшие компоненты. При определении антител в лунки, на которых сорбированы антигены, вносят исследуемую сыворотку крови, затем антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Проявляют реакцию, добавляя субстрат для фермента. В присутствии фермента субстрат изменяется, причем ферментсубстратный комплекс подбирают таким образом, чтобы образующийся в реакции продукт был цветным. Таким образом, при положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора. Для определения антигенов твердофазный носитель сенсибилизируется антителами, затем последовательно вносятся исследуемый материал (антигены) и сыворотка к антигенам, меченная ферментом. Для проявления реакции вносят субстрат для фермента. Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

13.6.3. Иммуноблоттинг

Этот метод основан на сочетании электрофореза и ИФА. При проведении иммуноблоттинга (блоттинг от англ. blot - пятно) сложную смесь антигенов вначале подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Полученные фракционированные анти-

генные пептиды переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Затем блоты обрабатывают антителами к специфическому антигену, меченными ферментом, т.е. проводят ИФА блота. Иммуноблоттинг используют в диагностике инфекций, например ВИЧ.

13.6.4. Иммунная электронная микроскопия

Метод заключается в микроскопировании в электронном микроскопе вирусов (реже других микробов), предварительно обработанных соответствующей иммунной сывороткой, меченной электроннооптически-плотными препаратами, например ферритином - железосодержащим белком.

13.7. Проточная цитометрия

Клетки крови дифференцируют на основе лазерной цитофлюорометрии. Для этого искомые клетки окрашивают флюоресцирующими моноклональными антителами к CD-антигенам. Образец крови после обработки мечеными антителами пропускают через тонкую трубку и через него пропускают лазерный луч, который возбуждает свечение флюорохрома. Интенсивность флюоресценции коррелирует с плотностью антигенов на поверхности клеток и может быть количественно измерена с помощью фотоумножителя. Полученные результаты преобразуются в гистограмму.

Проточную цитометрию применяют для определения иммунного статуса (содержание основных популяций лимфоцитов, содержание внутриклеточных и внеклеточных цитокинов, функциональная активность NK-клеток, активность фагоцитоза и др.).

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;